張利環(huán)，張若男，賈 浩，楊俊鵬，李慧鋒，朱芷葳，石 雄

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省晉中市太谷區(qū)小白鄉(xiāng)人民政府，山西太谷 030801）

在家禽生產(chǎn)中，抗生素的大量使用引起消費者擔(dān)憂，而益生菌具有安全、環(huán)保、無殘留等優(yōu)點，在動物生產(chǎn)中可作為抗生素替代品[1]。乳酸菌屬是最常見的益生菌，由多種不同的菌種組成[2]。有研究表明，乳酸菌可提高消化酶活性、促進(jìn)腸道代謝、改善飼料攝取和吸收[3]。乳酸菌還可黏附于腸道，改善肉雞腸道形態(tài)，如腸道通透性、黏膜免疫和黏液層，并通過改善腸道酶活性和營養(yǎng)有效性促進(jìn)腸道健康[4]。因此，益生菌被認(rèn)為是一種能維持腸道菌群平衡、對宿主動物產(chǎn)生積極影響的活性微生物[5]。

不同微生物添加劑的組成不同，不同菌株的飼喂效果存在差異。飲水中添加益生菌可阻止病原微生物增殖，調(diào)節(jié)有益的腸道菌群，從而改善肉雞健康、免疫狀態(tài)和生產(chǎn)性能[6]。但飲水中添加益生菌對肉雞腸道營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白影響的相關(guān)研究還缺乏資料。因此，本研究將探討在飲水中添加3 種不同的益生菌添加對肉雞生長性能、消化吸收及營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白的影響機(jī)制，為提高肉雞養(yǎng)殖的生產(chǎn)效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 將試驗凍干純菌菌粉（Danlsco，China）各取1 g，其中乳雙歧桿菌菌粉置于無菌牛乳中厭氧活化，干酪乳桿菌與嗜酸乳桿菌菌粉于MRS 肉湯（Hopebio，HB0384-1）中活化，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)14 h 后接種到改良MRS 固體培養(yǎng)基（Hopebio，HB0397）上，37℃下培養(yǎng)36 h 后，挑取大小均等、圓潤光滑的單菌落于200 mL 的30%無菌脫脂牛乳中擴(kuò)大培養(yǎng)14 h。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 1 日齡雄性麻花肉雞200 只隨機(jī)分為4 組，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只。對照組正常飲水；益生菌組全天飲水中加入1%益生菌，分別為干酪乳桿菌組、嗜酸乳桿菌組、乳雙歧桿菌組，益生菌的活菌密度分別為3×109、4.4×109、4.15×109CFU/mL。肉雞基礎(chǔ)日糧的配制參照NRC（1994）和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）。為確保試驗菌種活性，4℃保存益生菌并每6 h 更換飲水，益生菌每日重新配制。試驗期共42 d，分為2 個階段（1～21、22～42 d）。試驗期間，肉雞于立式籠內(nèi)飼養(yǎng)，按正常程序接種疫苗。試驗過程中光照連續(xù)，保證肉雞正?；顒樱杂蓴z食和取水，溫度從育雛第1 周的33℃每天降低1℃，直至降到23℃結(jié)束。每天早晚定時飼喂與觀察，記錄攝食量。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 生長性能測定 在21、42 d 時，稱量各組肉雞，肉雞稱重前禁食但自由飲水10 h，計算各組肉雞的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）與耗料增重比（F/G）。

1.3.2 取樣與小腸形態(tài)學(xué)測量 于21、42 d 分別抽取100 只（每個重復(fù)組5 只），屠宰后摘取的小腸各段樣本沖洗凈后，取樣1 cm2在4%甲醛固定液中過夜，經(jīng)脫水等一系列處理后嵌入石蠟，6 μm 橫切腸段后HE染色，測量小腸絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD）、絨毛高度與隱窩深度的比值（V/C）；摘取部分含內(nèi)容物的空腸組織，切口兩端棉線捆綁，與沖洗凈的空腸樣本一起冷凍在液氮中，便于隨后分子實驗。

1.4 消化酶活性測定 樣本在冰上解凍后，將內(nèi)容物與PBS按1:9（m:v）比例勻漿，低溫下3 000×g 離心20 min，使用雞用ELISA 試劑盒（mlbio，China）按說明書測定上清中淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LPS）和胰蛋白酶（TPS）的活性。

1.5 空腸總RNA 提取與qRT-PCR 根據(jù)試劑盒（TaKaRa）指示提取總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR 使用SYBR green（TaKaRa，SYBR Premix Ex TaqTMIIKit）檢測空腸GLUT2的表達(dá)水平。PCR 循環(huán)：95℃ 5 min 變性；95℃ 5 s 擴(kuò)增，40 次；60℃ 35 s 退火，72℃ 20 s 延伸循環(huán)。使用的引物由Primer 3.0 獲得，目標(biāo)擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析確定反應(yīng)的特異性。每個樣本均進(jìn)行重復(fù)測量，以β-actin為參考基因，按照公式P=2-ΔΔCT計算GLUT2mRNA 的相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 分析，采用Duncan's 檢驗各組間性狀平均值的顯著性差異，運用GraphPad Prism 8 進(jìn)一步分析并制作柱狀圖。P>0.05 表示差異不顯著，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌對肉雞生長性能的影響 如表2 所示，在整個試驗期間，與對照組相比，益生菌組肉雞的初體重、ADFI 和F/G 無顯著差異，末體重與ADG 增加（P<0.05），且益生菌組間差異不顯著，各益生菌組中以乳雙歧桿菌組肉雞的生長性能較好。

表2 不同益生菌對肉雞生長性能的影響

2.2 不同益生菌對肉雞空腸消化酶活性的影響 如表3 所示，在21 d 時，與對照組相比，干酪乳桿菌組與乳雙歧桿菌組空腸消化酶（AMY、LPS、TPS）的活性顯著提高，其中以乳雙歧桿菌組的活性最高。嗜酸乳桿菌組AMY 的活性顯著提高，LPS 與TPS 的活性無顯著差異；在42 d 時，與對照組相比，嗜酸乳桿菌組AMY 與TPS 的活性、乳雙歧桿菌組LPS 的活性顯著提高，且在益生菌組中最高，干酪乳桿菌組空腸消化酶活性顯著提高。

2.3 不同益生菌對肉雞小腸形態(tài)學(xué)變化的影響 如表4所示，在整個試驗期間，與對照組相比，添加益生菌皆可顯著提高肉雞小腸（十二指腸、空腸和回腸）的VH與V/C 值，降低CD（P<0.05）。在21 d 時，在3 個益生菌組中，干酪乳桿菌組回腸VH 較其他2 個益生菌組顯著提高，乳雙歧桿菌組小腸前段（十二指腸與空腸）的VH 與V/C 值顯著提高。在42 d 時，在3 個益生菌組中，干酪乳桿菌組回腸VH 與V/C 值顯著提高，嗜酸乳桿菌組小腸前段的VH 顯著提高，乳雙歧桿菌組小腸前段的V/C 值顯著提高，小腸CD 顯著降低。

表3 不同益生菌對肉雞空腸消化酶活性的影響

表4 不同益生菌對肉雞小腸形態(tài)變化的影響

2.4 不同益生菌對肉雞空腸GLUT2表達(dá)的影響 如圖1所示，在21 d 時，與對照組相比，空腸GLUT2mRNA 表達(dá)量在乳雙歧桿菌組中最高（P<0.05），其次是干酪乳桿菌組（P<0.05），嗜酸乳桿菌組GLUT2mRNA 的表達(dá)上調(diào)，但不顯著（P>0.05）。在42 d 時，與對照組相比，3 個益生菌組皆上調(diào)了GLUT2表達(dá)（P<0.05），且嗜酸乳桿菌組GLUT2mRNA 表達(dá)量高于干酪乳桿菌組與乳雙歧桿菌組（P<0.05）。

圖1 不同益生菌對肉雞GLUT2 mRNA 表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 益生菌對肉雞生產(chǎn)性能的影響 家禽生產(chǎn)性能可反映其所具有高效生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品的能力。本研究結(jié)果顯示，益生菌對肉雞的ADFI 沒有影響，但可改善肉雞ADG 與F/G，表明試驗所用菌株可改善肉雞的生長性能且不會影響雞的食欲。夏億等[7]發(fā)現(xiàn)，1×109CFU/kg 發(fā)酵乳桿菌可抵抗致病菌，使肉雞ADG 和ADFI 分別提高3.21%和2%，提高生長性能。刑爽等[8]分析發(fā)現(xiàn)，飲水或飼料中添加105～1010CFU/g 的乳酸桿菌能顯著促進(jìn)1～42 d肉雞的生長，且促生長作用在前期效果較好。Ahmed 等[9]研究表明，日糧中添加5 g/kg CJP（含嗜酸乳桿菌等多菌株于香橙發(fā)酵的副產(chǎn)品，微生物濃度為2×107CFU/g），對35 d 的肉雞有相同的積極效應(yīng)。然而，也有一些研究報道結(jié)果與之相反。王雪飛等[10]和Samanya 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，7.67×107CFU/g 的雙歧桿菌和108～1010CFU/g的納豆枯草桿菌對肉雞的ADG、ADFI 和耗料增重比均無顯著影響。Karaoglu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，4×108CFU/g的釀酒酵母對肉雞的生長和屠宰性能沒有影響。有研究表明，益生菌對動物生產(chǎn)的有益作用可能與腸道微生物群的變化有關(guān)[13]。1.0×1010CFU/g 的乳桿菌可增加腸道中乳酸菌和雙歧桿菌屬數(shù)量，降低大腸桿菌等致病菌數(shù)量，降低死亡率[14]。2.0×1010CFU/g 的芽孢桿菌可增加厚壁菌門與硬毛門的豐度，較高的厚壁菌門與擬桿菌比率、硬毛門與擬桿菌比率可導(dǎo)致肥胖，進(jìn)而提高肉雞的生長性能[15]。益生菌的有益作用存在差異，這種差異可能由微生物種類和制備方法、給藥濃度和方式以及雞的品種、飲食組成和衛(wèi)生條件等許多因素造成。此外，本研究中乳雙歧桿菌提高肉雞生產(chǎn)性能的效應(yīng)比干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌好，這可能由于乳雙歧桿菌在胃腸道中的生存能力較高，胃腸道中有效的菌株可競爭排除致病菌，刺激免疫和增加上皮完整性，更好地利用營養(yǎng)物質(zhì)，從而在動物體內(nèi)帶來健康益處。

3.2 益生菌對肉雞空腸消化酶活性的影響 腸道消化酶在營養(yǎng)物質(zhì)利用過程中至關(guān)重要。消化酶特異性活性的增加有助于提高胃腸道營養(yǎng)的可獲得性。多年來，關(guān)于益生菌影響腸道消化酶活性的相關(guān)報道多種多樣。李璐琳等[16]研究表明，27 d 起飲水飼喂1.374×107CFU/mL的酵母菌發(fā)酵液能顯著提高56 d 肉雞十二指腸AMY 活性。Jin 等[17]對雞補(bǔ)充1～2×109CFU/g 的嗜酸乳桿菌或其培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)40 d 后小腸AMY 水平顯著增加，但未顯著增加TPS 水平。劉婷[18]對肉雞灌胃2.15×108CFU/mL的短乳桿菌M8，發(fā)現(xiàn)56 d 后小腸AMY 活性提高18.52%，TPS 活性提高29.17%。郭元晟等[19]研究表明，2×106CFU/mL 的干酪乳桿菌對空腸與回腸中AMY 活性、十二指腸中TPS 刺激作用顯著，對小腸LPS 活性無影響。而本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飲水飼喂1%發(fā)酵菌能顯著增加空腸AMY、LPS、TPS 活性，且益生菌對消化酶影響的差異與喂養(yǎng)周期和菌株類別有關(guān)。干酪乳桿菌與乳雙歧桿菌對空腸消化酶活性的刺激作用在生長初期最好（1～21 d），而嗜酸乳桿菌的的最佳效應(yīng)表現(xiàn)在生長后期（22～42 d）。益生菌對消化酶的作用模式可能包括其在腸壁快速定殖并產(chǎn)生能抑制有害細(xì)菌生長的物質(zhì)，保護(hù)腸道不被感染，為酶生存提供更好的環(huán)境；益生菌代謝活動降低消化液的pH，促進(jìn)消化酶合成與分泌。消化酶活性增加提高了食物中營養(yǎng)的利用率，進(jìn)而更好解釋益生菌對生長性能與飼料利用率的有益作用。

3.3 益生菌對肉雞小腸形態(tài)變化的影響 腸道上皮的結(jié)構(gòu)和完整性是影響消化能力的重要因素，絨毛是腸上皮結(jié)構(gòu)最明顯的特征，它包含一個動態(tài)的、自我更新的上皮細(xì)胞群。一般來說，高V/C 值表明腸絨毛的細(xì)胞充分成熟并且功能活躍，有較大的腸表面積，便于吸收營養(yǎng)，同時伴有較淺的隱窩，細(xì)胞不斷更新，以促進(jìn)肉雞生產(chǎn)。大量研究表明，益生菌對腸結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)育有益。史洪濤等[20]發(fā)現(xiàn)，在飲水中添加1.0×109CFU/mL 的乳酸菌可提高肉雞小腸VH 與V/C 值，CD 降低，小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)改善。Awad 等[21]表示，飼料中添加108CFU/kg 乳桿菌可增加肉雞十二指腸VH。104CFU/mL 的腸球菌和109CFU/kg 的芽孢桿菌也有此積極效應(yīng)[22-23]。本研究結(jié)果也表明，3 種益生菌均能改善腸道形態(tài)，在整個生長階段（1～42 d）內(nèi)，乳雙歧桿菌對小腸絨毛組織形態(tài)發(fā)育的影響最顯著，其次是干酪乳桿菌，而嗜酸乳桿菌在腸道中的最佳效應(yīng)主要體現(xiàn)在生長后期（22～42 d）小腸前段的絨毛發(fā)育。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸（SCFA）是腸上皮細(xì)胞必須的能量來源[24]。腸性能參數(shù)的改善可能是由于益生菌發(fā)酵降低pH，增加滲透壓，促進(jìn)質(zhì)子交換產(chǎn)生大量SCFA，SCFA 調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分化和凋亡，改善腸道微結(jié)構(gòu)，刺激黏膜發(fā)育，增加吸收表面積和吸收能力，最終提高飼料利用效率。益生菌提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率及其可用性吸收，反過來可增強(qiáng)消化酶活力。

3.4 益生菌對肉雞GLUT2表達(dá)的影響 營養(yǎng)物質(zhì)從腸腔的吸收以及隨后供腸和其他組織使用的有效性都需要一些營養(yǎng)轉(zhuǎn)運體的作用。在葡萄糖轉(zhuǎn)運體中，GLUT2是一種高容量的促進(jìn)性轉(zhuǎn)運蛋白，可運輸單糖跨越基底外側(cè)膜，并在葡萄糖刺激細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到刷狀緣，確保葡萄糖穿過腸腔被吸收到細(xì)胞中，隨后進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)[25-26]。GLUT2表達(dá)量可能是決定腸道消化吸收能力的重要因素，其特殊生理作用涉及葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。有研究表明，喂食肉雞109CFU/g 的乳酸菌可在較低溫度下增加糖轉(zhuǎn)運體基因的表達(dá)[27]。1010CFU/g的芽胞桿菌可激活空腸中GLUT2的表達(dá)[28]。本研究結(jié)果也表明，3 種益生菌均能調(diào)控GLUT2過表達(dá)，且上調(diào)效果存在微生物種類以及飼喂時間的差異。益生菌的增強(qiáng)效果可能與其改變腸道pH、發(fā)酵產(chǎn)生高水平的總SCFA（包括丙酸和丁酸）等生物學(xué)作用有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)SCFA 可作用于轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)，SCFA 可增加回腸GLUT2mRNA 和蛋白質(zhì)的豐度[29]。丁酸鹽是腸道菌群產(chǎn)生的SCFA 之一，體外暴露于丁酸鹽培養(yǎng)液中的回腸細(xì)胞，其GLUT2啟動子被激活，GLUT2mRNA豐度較高，作用方式受丁酸鹽劑量和孵育時間的影響[30]。此外，本試驗中3 種益生菌在轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)上作用效果的差異與其在消化酶活性、腸道微結(jié)構(gòu)上的作用效果相似。因此，益生菌刺激腸道消化酶的增殖，引起腸壁結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變，可能刺激GLUT2過表達(dá)參與營養(yǎng)轉(zhuǎn)運過程，營養(yǎng)物質(zhì)流量的增加進(jìn)一步促進(jìn)肉雞的生長性能。但以目前研究結(jié)果來說，益生菌對營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白的具體作用機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，益生菌能夠增加消化酶的分泌和活性、改善消化道形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜GLUT2過表達(dá)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，進(jìn)而提高肉雞的生長性能；且3 種益生菌相比，乳雙歧桿菌在腸道內(nèi)具有更高的活性，肉雞表現(xiàn)出較好的生長性能。