糞腸球菌預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的研究

李重 陳飛 王洪偉

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和死亡率位于前列的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］?；熓墙Y(jié)直腸癌治療的重要手段，特別是對(duì)于晚期結(jié)直腸癌患者，化療能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，縮小腫瘤體積和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。以氟尿嘧啶和卡培他濱為代表的細(xì)胞毒性藥物，能夠抑制胸苷合成酶的活性，從而抑制DNA復(fù)制［2］。奧沙利鉑是另外一種常用于治療結(jié)直腸癌的細(xì)胞毒性藥物。奧沙利鉑通過(guò)與DNA分子共價(jià)結(jié)合，形成DNA加合物，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)G2期阻滯［3］。在結(jié)直腸癌治療中，上述兩種藥物的聯(lián)合治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用。雖然多數(shù)患者初始對(duì)于奧沙利鉑和氟尿嘧啶的反應(yīng)良好，但是仍然有部分患者最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)。有研究顯示，復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌患者5年生存率不足10%［4］。所以，探索結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

腫瘤的復(fù)發(fā)涉及腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用。近些年來(lái)腸道微生物的研究逐步開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)了腸道菌群與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。腸道菌群可以通過(guò)影響腸道內(nèi)的炎癥水平和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能［5-8］。一項(xiàng)利用小鼠模型的研究顯示，腸道菌群能夠影響腸道黏膜內(nèi)的免疫狀態(tài)，從而影響化療和免疫治療的效果［9-10］。人類(lèi)消化道中的菌群也與炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)［11］。糞腸球菌是一種消化道常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性球菌。目前，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，糞腸球菌豐度在結(jié)直腸癌中顯著高于結(jié)直腸息肉患者和健康人群［12］。糞腸球菌能夠促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的增殖［13］，而且可以通過(guò)葡萄糖醛酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)加快結(jié)腸炎的發(fā)展［14］。糞腸球菌感染可能與慢性胰腺炎及腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系［15］。由此可見(jiàn)，糞腸球菌在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。但是，目前糞腸球菌與腫瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，我們通過(guò)選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)患者與非復(fù)發(fā)患者的糞便樣本。通過(guò)16s測(cè)序技術(shù)，探索腸道菌群與結(jié)直腸腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。闡述糞腸球菌對(duì)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的臨床意義。

材料與方法

一、臨床樣本的選擇

本研究所有的患者及樣本均來(lái)自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科。自2015年1月至2016年12月，共103例患者經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌，術(shù)前通過(guò)胸部及全腹CT排除遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。同時(shí)收集患者的臨床信息及糞便樣本。所有患者均接受手術(shù)治療，外科手術(shù)后，患者接受標(biāo)準(zhǔn)的XELOX方案化療，根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)診斷共有復(fù)發(fā)患者39例，非復(fù)發(fā)患者64例［18］。匹配年齡、性別及腫瘤分期等臨床指標(biāo)后，選擇10對(duì)復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)患者用于16sRNA測(cè)序，其余29例復(fù)發(fā)患者及54例非復(fù)發(fā)患者用于PCR驗(yàn)證。本研究方案經(jīng)過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，手術(shù)前患者均簽署了知情同意書(shū)。使用胸部及全腹增強(qiáng)CT及腸鏡檢測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況，并進(jìn)行電話隨訪，隨訪間隔為3個(gè)月，連續(xù)隨訪3年。

二、16s高通量測(cè)序

共收集103份糞便樣本，DNase酶處理后，經(jīng)過(guò)RNeasy Mini柱分離純化獲得高純度RNA。分離的RNA樣本使用安捷倫2 100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量控制。RNA樣本在Illumina Hiseq 3000平臺(tái)進(jìn)行150 bp的雙端測(cè)序。RNA測(cè)序數(shù)據(jù)使用TopHat-HTSeq-DeSeq2軟件處理［16］。測(cè)序讀數(shù)數(shù)據(jù)使用TopHatv2.0.11軟件比對(duì)（humangenome，hg19）［17］。根據(jù)Ensembl_GRCh37數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)值建立基因名稱索引。通過(guò)HTSeq包和GTF注釋文件，將測(cè)序數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為讀數(shù)文件。將每個(gè)樣本的讀數(shù)文件整理為表達(dá)矩陣，用于后續(xù)差異表達(dá)的篩選。使用DESeq2包篩選差異表達(dá)基因，其中讀數(shù)小于5的基因認(rèn)為無(wú)表達(dá)，不予以分析。

三、糞腸球菌檢測(cè)

根據(jù)既往研究的報(bào)道，合成檢測(cè)糞腸球菌所需要的引物。新鮮糞便樣本中的基因組DNA通過(guò)QIAamp DNA Mini試劑盒提取。每個(gè)樣本的基因組DNA用于PCR檢測(cè)糞腸球菌表達(dá)量的檢測(cè)。反應(yīng)體系配制如下：40 ng的gDNA，10 μL的1×Power SYBR Green PCR混合液，0.4 μM的正向與反向引物置于96孔板中。通過(guò)ABI公司7500 Real-Time PCR System擴(kuò)增檢測(cè)糞腸球菌的表達(dá)。擴(kuò)增條件如下：95℃10分鐘；95℃15秒鐘，反復(fù)40循環(huán)；60℃持續(xù)1分鐘。糞腸球菌的表達(dá)量用Ct值表示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R軟件完成（www.rproject.org）。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少經(jīng)過(guò)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差展示。使用單樣本的Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)分布。如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間的比較使用單樣本方差分析。如果樣本不滿足正態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩樣本之間的比較使用Mann-Whitney檢驗(yàn)。生存數(shù)據(jù)使用Kaplan-Meier曲線分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、糞便糞腸球菌與結(jié)直腸腫瘤患者的復(fù)發(fā)相關(guān)

本研究對(duì)10對(duì)結(jié)直腸腫瘤復(fù)發(fā)患者和非復(fù)發(fā)患者糞便樣本進(jìn)行16s測(cè)序分析。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA），發(fā)現(xiàn)16s數(shù)據(jù)可以對(duì)復(fù)發(fā)患者和非復(fù)發(fā)患者進(jìn)行區(qū)分（圖1）。對(duì)16s測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)行線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA），同時(shí)篩選得到在復(fù)發(fā)患者中豐度增高的菌群，如糞腸球菌、具核梭桿菌、脆弱擬桿菌；也篩選得到了在復(fù)發(fā)患者中豐度降低的菌群，如韋榮氏球菌、窄食單胞菌等；本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌在復(fù)發(fā)患者糞便中豐度最高，作為后續(xù)研究的潛在靶點(diǎn)（圖2）。根據(jù)我們收集的另外83例樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)的患者糞便中，糞腸球菌的豐度更高（圖3）。

圖1 10對(duì)復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)患者糞便樣本PCA分析

圖2 16s測(cè)序差異表達(dá)菌群的LDA分析

圖3 83例復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)患者糞腸球菌的表達(dá)比較

二、糞腸球菌表達(dá)量與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

根據(jù)糞腸球菌的相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)，本研究將103例患者分為糞腸球菌高豐度組和低豐度組。通過(guò)收集所有患者的臨床病例資料，發(fā)現(xiàn)在糞便樣本中糞腸球菌高豐度患者組在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓、神經(jīng)侵犯這四方面數(shù)據(jù)更高。而且，還發(fā)現(xiàn)該組Ⅲ期患者所占的比例也更高（表1）。

表1 糞腸球菌表達(dá)量與患者的一般病理特征關(guān)系（例）

三、糞腸球菌與患者的生存密切相關(guān)

本研究對(duì)103例樣本進(jìn)行生存分析統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)糞便中糞腸球菌豐度更高的患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間更短（χ2=5.82，P=0.02）（圖4），總生存時(shí)間更短（χ2=6.44，P=0.01）（圖5）。

圖4 無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間

圖5 總生存時(shí)間

討 論

卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑在結(jié)直腸癌術(shù)后的輔助治療中取得了一定的療效［3］。這種聯(lián)合治療方案對(duì)大部分患者在起始階段具有一定的療效，而一部分患者最終會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)［19-20］。復(fù)發(fā)患者對(duì)于后續(xù)的化療和免疫治療均不敏感［21］。因此，探索復(fù)發(fā)相關(guān)的分子標(biāo)志物，篩選藥物治療敏感的患者，具有潛在的臨床意義。

已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因組改變和表觀遺傳改變是腫瘤復(fù)發(fā)的分子機(jī)制［22-24］。最近基于小鼠模型的研究，顯示腸道微生物能夠調(diào)節(jié)腸道局部免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響腫瘤對(duì)藥物的敏感性［25-26］和免疫治療的療效［9-10］。另外基于人群的研究也顯示腸道微生物可以通過(guò)影響適應(yīng)性免疫，調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)于化療的敏感性［27］。通過(guò)16sRNA測(cè)序技術(shù)，本研究對(duì)復(fù)發(fā)患者與非復(fù)發(fā)患者的樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌在復(fù)發(fā)患者的糞便樣本中高度富集。既往研究發(fā)現(xiàn)，菌群是促進(jìn)腸癌發(fā)展的重要因素。通過(guò)宏基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌可以通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞表面的E-cadherin蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［28］。具核梭桿菌同樣可以誘導(dǎo)LC3II的表達(dá)，促進(jìn)自噬流和自噬小體的形成，增加了結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［29］。由此可見(jiàn)，腸道菌群在結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們的研究提示了糞腸球菌可能在結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用，因此進(jìn)一步探索糞腸球菌影響腫瘤復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，有潛在的應(yīng)用價(jià)值。既往研究還發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可以作為人類(lèi)疾病診斷或判斷疾病預(yù)后的分子標(biāo)志物。Jiang等［30］報(bào)道了擬桿菌，變形菌，放線菌和厚壁菌與人類(lèi)抑郁情緒相關(guān)。在結(jié)直腸癌患者中，腸道具核梭桿菌高豐度患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間更長(zhǎng)［29］。另外的一項(xiàng)研究報(bào)道表明，糞便樣本中高豐度具核梭桿菌預(yù)測(cè)了結(jié)直腸癌患者更短的總生存時(shí)間［31］。同既往的研究類(lèi)似，我們的研究也發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸腫瘤患者糞便中糞腸球菌的含量與結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)存在一定聯(lián)系，糞便中糞腸球菌豐度高者預(yù)后更差。糞腸球菌也是與結(jié)腸癌相關(guān)的細(xì)菌，有研究發(fā)現(xiàn)了在結(jié)直腸癌患者糞便中，糞腸球菌豐度更高［32-33］。腸道中的糞腸球菌能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞內(nèi)的超氧化物形成，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷［34-37］。我們的研究結(jié)果也說(shuō)明了糞腸球菌可能是結(jié)直腸癌發(fā)展的促進(jìn)因素之一。與既往研究不同，本研究率先利用復(fù)發(fā)患者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)。既往的研究還揭示了糞腸球菌能夠破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞的DNA，激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性［37］。

綜上所述，本研究顯示糞腸球菌與結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了高富集糞腸球菌的患者總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間更短。這些研究結(jié)果顯示了基于糞便樣本的糞腸球菌檢測(cè)具有一定的臨床意義，能為結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的早期診斷提供一些新的策略。同時(shí)，通過(guò)本研究我們有理由相信糞便樣本中糞腸球菌豐度可能成為未來(lái)判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后新的標(biāo)志物。