畢 磊 劉 輝 武 燃

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸修復(fù)科，河北省唐山市 063000，電子郵箱：bilei18631575530@163.com)

牙周病是由細(xì)菌感染引起的一種慢性炎性疾病，可導(dǎo)致牙齦發(fā)炎、牙槽骨損傷，牙周炎患者常出現(xiàn)牙齦出血、袋囊炎等癥狀[1-2]。牙周病引起機(jī)體成骨形成與破骨吸收失衡，過多的骨吸收與牙槽骨損傷密切相關(guān)[3]。破骨細(xì)胞主要發(fā)揮骨吸收作用，其分化由多種因子共同調(diào)控[4]。核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)與其配體結(jié)合可活化活化T細(xì)胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1)，參與調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[5]。此外，牙周組織中炎性細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生以及氧化應(yīng)激反應(yīng)可加劇牙周病的發(fā)生[6]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)控因子，在氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[7]。Nrf2通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，從而抑制破骨細(xì)胞的分化[8]。黃芩素是黃芩屬草本植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能[9]。研究表明，黃芩素可以通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路，減少牙槽骨丟失[10]。但關(guān)于黃芩素對牙周病患者破骨細(xì)胞的影響的研究較少。故本研究探討黃芩素對牙周病大鼠破骨細(xì)胞形成牙槽骨吸收的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體重180～210 g，由本院實(shí)驗動物中心提供。實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 2018-0004；實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK 2018-0051；動物質(zhì)量合格證號：19061708。

1.2 主要試劑及儀器 黃芩素(批號：MB6699)購自美侖生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：ml063132)、IL-6 ELISA試劑盒(批號：ml063159)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號：ml002095)均購自上海酶聯(lián)生物科技公司；活性氧初級綠色熒光測定試劑盒(批號：HL100164)購自上海哈靈生物科技有限公司；谷胱甘肽ELISA試劑盒(批號：BC1175)、丙二醛ELISA試劑盒(批號：BC0025)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒(批號：BC0175)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)檢測試劑盒(批號：G1492)均購自北京索萊寶科技有限公司；兔多克隆Nrf2抗體(批號：ab92946)、兔多克隆NF-κB抗體(批號：ab7549)、兔單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號：ab181602)購自英國Abcam公司；鼠單克隆NFATc1抗體(批號：sc-7294)購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；酶聯(lián)免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司；手術(shù)器械(型號：11231-220-230)購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；生物顯微鏡(型號：Eclipse E200)購自日本尼康公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號：GelDoc EZ)購自美國伯樂公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 分組牙周病大鼠模型的構(gòu)建：將SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組，每組10只。除對照組外，其他組制備牙周病大鼠模型。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為0.2 mL/100 g；用4.0絲線伸入齦溝，結(jié)扎大鼠上頜右側(cè)第二磨牙，采用眼科細(xì)剪割破牙齦，劃入齦溝1 mm深[11]。造模1周后，觀察大鼠牙周情況，如存在牙齦處紅腫、探診出血、深牙周袋形成則確認(rèn)牙周炎模型構(gòu)建成功。分別在黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠上頜右側(cè)第一和第二磨牙間腭側(cè)、頰側(cè)的齦溝底注入黃芩素，劑量分別為2.5 mg/(kg·d)、5.0 mg/(kg·d)，1次/d，在對照組與模型組大鼠相同位置注入等量生理鹽水，均連續(xù)給藥7 d。

1.3.2 標(biāo)本采集：末次給藥后禁食12 h，取各組大鼠尾靜脈血4 mL，靜置后室溫下3 500 r/min離心10 min，留取血清，-80℃儲存?zhèn)溆谩Ｓ?0%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉處死大鼠，分離右側(cè)磨牙區(qū)段頜骨并用4%多聚甲醛固定備用；取牙周組織，剪取約0.5 g儲存在-80℃冰箱中備用，剩余牙周組織置于4%多聚甲醛中固定，做常規(guī)石蠟切片，備用。

1.3.3 影像學(xué)檢測大鼠牙槽骨吸收情況：取1.3.2中用4%多聚甲醛固定的磨牙區(qū)段頜骨，進(jìn)行三維CT拍攝，測量釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂(cementum-enamel junction to alveolar bone crest，CEJ-ABC)的距離，測量3次后取均值代表牙槽骨吸收度。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠牙周組織病理變化：取1.3.2中制備的牙周組織切片，脫蠟至水化，蘇木精染色、伊紅染液復(fù)染，不同梯度乙醇脫水，透明，封片，鏡下觀察牙周組織病理變化。

1.3.5 TRAP染色法計數(shù)大鼠牙周組織破骨細(xì)胞：將1.3.2中制備的牙周組織切片常規(guī)脫蠟水化，然后按照TRAP檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，吹干后，用中性明膠封片，顯微鏡下觀察并進(jìn)行破骨細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞核為藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)為紅色的細(xì)胞判定為破骨細(xì)胞，鏡下隨機(jī)選取5個視野(200倍)，計數(shù)破骨細(xì)胞個數(shù)，取平均數(shù)。

1.3.6 檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及活性氧、SOD活性：取1.3.2中保存的血清，采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及SOD活性，采用活性氧初級綠色熒光測定試劑盒檢測活性氧活性，具體操作步驟均參考其說明書。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)水平：取牙周組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA組織裂解液，研磨后，12 000 r/min離心30 min，留取上清液，采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度；調(diào)整上樣蛋白至50 μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、加一抗(兔多克隆Nrf2抗體、兔多克隆NF-κB抗體、鼠單克隆NFATc1抗體、兔單克隆GAPDH抗體的稀釋比例均為1 ∶1 000)，4℃孵育過夜；次日加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加電化學(xué)發(fā)光液，采用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測蛋白灰度，采用Image J軟件定量分析Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)水平。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參(GAPDH)蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 (x±s)表示，多組間比較方差齊時行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠牙槽骨吸收情況 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度依次降低(均P<0.05)。見圖1及表1。

圖1 4組大鼠牙槽骨吸收情況三維CT圖像

表1 4組大鼠牙槽骨吸收度的比較(x±s ，mm)

2.2 4組大鼠牙周組織病理學(xué)變化 對照組大鼠牙周組織無明顯病理變化，表現(xiàn)為纖維排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠牙周組織上皮增生，膠原纖維排列紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤較模型組明顯減少。見圖2。

圖2 4組大鼠牙周組織病理變化(蘇木精-伊紅染色，標(biāo)尺=50 μm，×200)

2.3 4組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)增多(均P<0.05)；模型組相、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)依次減少(均P<0.05)。見圖3及表2。

圖3 4組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞鏡下圖像(TRAP染色，標(biāo)尺=50 μm，×200)

表2 4組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量的比較(x±s，個)

2.4 4組大鼠血清炎癥因子水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高(均P<0.05);模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清IL-6水平均高于對照組與黃芩素高劑量組(均P<0.05)，而對照組與黃芩素高劑量組血清IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清炎癥因子水平的比較(x±s，pg/mg)

2.5 4組大鼠血清氧化應(yīng)激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清丙二醛水平升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(均P<0.05)，黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清谷胱甘肽水平均高于模型組(均P<0.05)，而黃芩素低劑量組與黃芩素高劑量組的谷胱水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組大鼠血清氧化應(yīng)激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比較(x±s)

2.6 4組大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達(dá)水平依次升高，NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見圖4及表5。

圖4 4組大鼠牙周組織Nrf2/NF-κB/NFATc1信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平

表5 4組大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

牙周病是常見的口腔疾病，是導(dǎo)致患者牙齒喪失的主要原因，嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量。牙槽骨吸收是牙周病的主要病理特征，本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠牙周組織上皮增生，膠原纖維排列紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度升高(P<0.05)，這與胡芳等[12]的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果提示牙周病大鼠模型構(gòu)建成功。黃芩素是從唇形科植物黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，且以上3組的牙槽骨吸收度依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以降低牙槽骨吸收度，減輕牙周病癥狀，且呈劑量依賴性。

破骨細(xì)胞是一種多核巨細(xì)胞，與骨吸收過程密切相關(guān)，在牙周炎、骨質(zhì)疏松癥等多種溶骨性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用[14]。NFATc1可介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，在破骨細(xì)胞生長過程中發(fā)揮作用，研究顯示牙周炎小鼠體內(nèi)NFATc1表達(dá)水平升高，破骨細(xì)胞增多[15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)增多，NFATc1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，提示破骨細(xì)胞及NFATc1與牙周病的發(fā)生密切相關(guān)。付方勝等[16]的研究顯示，黃芩素可以抑制破骨細(xì)胞分化。本研究結(jié)果也顯示，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)依次減少，NFATc1蛋白表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以降低牙周組組織中NFATc1蛋白表達(dá)水平，并有效抑制牙周組織中破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。在病理條件下，活化的免疫細(xì)胞分泌的多種促炎細(xì)胞因子有助于破骨細(xì)胞的分化和活化[3]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，這與Yu等[17]的研究結(jié)果相似，提示牙周病大鼠體內(nèi)炎性因子分泌增加，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。Li等[18]的研究顯示，黃芩素可以有效降低牙齦上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6表達(dá)水平，有顯著抗炎作用。本研究結(jié)果也顯示，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以減少炎性因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)。由此推測黃芩素可以通過抑制炎癥因子分泌，從而減少破骨細(xì)胞生成，進(jìn)而減少牙槽骨吸收。

機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在牙周炎病中內(nèi)源性氧化應(yīng)激水平增加[19]?；钚匝醯漠a(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡在牙周健康中起著重要作用，機(jī)體中活性氧過量會引起氧化應(yīng)激[20]，谷胱甘肽、SOD、丙二醛共同參與機(jī)體的氧化反應(yīng)，是評價氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清氧化應(yīng)激因子谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清丙二醛水平升高(P<0.05)，提示牙周病引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。而模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清氧化應(yīng)激因子谷胱甘肽水平、SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以減輕牙周病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Nrf2是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的主要調(diào)控因子，通過與編碼基因啟動子區(qū)域中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，其不僅可以上調(diào)SOD、血紅素加氧酶-1等解毒基因和抗氧化劑的表達(dá)，還可以抑制細(xì)胞因子、炎癥趨化因子、細(xì)胞黏附因子等促炎因子的表達(dá)[21-22]。NF-κB介導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生，在控制炎癥損傷中起關(guān)鍵作用[23]。Qi等[24]的研究顯示，激活Nrf2信號通路可以抑制NF-κB活化，從而減輕人牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，NF-κB蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，提示牙周病的發(fā)生與Nrf2、NF-κB相關(guān)；而模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達(dá)水平依次升高，NF-κB蛋白表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可能通過調(diào)控Nrf2/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)以抑制炎性因子分泌，從而減少破骨細(xì)胞增加，降低牙槽骨吸收度。

綜上所述，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/NF-κB/NFATc1信號通路，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少破骨細(xì)胞增加，進(jìn)而降低牙槽骨吸收度，有效緩解牙周病癥狀。但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。