王增慧 張傳禎 吳 倩 劉 煥 湯琳琳 胡 超 馮均軍 陳復(fù)興 周忠海 朱 云

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇省徐州市 221004，電子郵箱：wang97yy@163.com；中國(guó)人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院2 消化內(nèi)科，3 麻醉科，4 檢驗(yàn)-病理科，江蘇省徐州市 221004)

芝麻素是天然的木脂類化合物，在芝麻油和芝麻種子中含量均較高，其藥理作用十分廣泛，如抗氧化、穩(wěn)定血壓、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)肝臟及抑制腫瘤生長(zhǎng)等[1-2]。日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院所開展的研究證實(shí)芝麻素具有抗腫瘤的功效，低濃度的芝麻素飲食可能對(duì)肝癌有抑制作用[3]，國(guó)內(nèi)也有研究證實(shí)芝麻素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[4-5]。近年來，γδ T細(xì)胞在抗腫瘤方面的作用逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的廣泛關(guān)注，其主要分布在黏膜及上皮組織內(nèi)，主要通過主要組織相容性復(fù)合物以非限制性方式，以及通過其固有免疫和適應(yīng)性免疫的輔助作用，來識(shí)別及殺傷腫瘤細(xì)胞[6-8]。提高γδ T細(xì)胞的增殖率及增強(qiáng)其功能，有利于更有效地將γδ T細(xì)胞應(yīng)用于生物學(xué)研究以及發(fā)揮其臨床抗腫瘤作用。因此，本研究探討芝麻素對(duì)人外周血中γδ T細(xì)胞體外增殖及殺傷胃癌細(xì)胞株BCG-823作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 GT-T551無血清培養(yǎng)基(日本TAKARA公司，批號(hào)：AK2P027)；淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院血液病研究所，批號(hào)：LTS1077)；芝麻素(Sigma公司，批號(hào)：#028M4099V)；人胃癌細(xì)胞株BCG-823(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)：BNO0102269)；胰蛋白酶(Gibco公司，批號(hào)：011020200528)；重組人白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2(雙鷺?biāo)帢I(yè)，批號(hào)：S19991007)；異戊烯焦磷酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司,批號(hào)：SLCB2751)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：BD-FACSCalibur)；酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：ST-360)；貝克曼自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼，型號(hào)：AU680)；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑(上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：010919190408)；γδ T細(xì)胞抗體(美國(guó)BD公司，批號(hào)：6029567)； 穿孔素單抗(eBioscience公司，批號(hào)：E020894)、顆粒酶B單抗(eBioscience公司，批號(hào)E106781638)、CD107a單抗(eBioscience公司，批號(hào)：B181677)、Fix&Perm破膜劑(eBioscience公司，批號(hào)：749349340)；乳酸脫氫酶試劑 (寧波普瑞柏生物技術(shù)公司，批號(hào)：LD0359)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 γδ T細(xì)胞的培養(yǎng)及表型鑒定：取5名健康男性志愿者(平均年齡為35周歲)外周血各100 mL，肝素抗凝，各取100 μL抗凝血采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的γδ T細(xì)胞抗體進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞的表型。剩下的抗凝血分別采用淋巴細(xì)胞分離液分離后吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入50 mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌1遍后，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄去上清，沉淀即為獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞，將加入GT-T551無血清培養(yǎng)基(含誘導(dǎo)γδ T細(xì)胞的細(xì)胞因子，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL，放入培養(yǎng)瓶后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天觀察γδ T細(xì)胞生長(zhǎng)情況并適量補(bǔ)充培養(yǎng)基；培養(yǎng)10 d后，收集部分γδ T細(xì)胞，室溫下1 500 r/min離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2遍，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的γδ T細(xì)胞抗體進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞的表型；當(dāng)γδ T細(xì)胞的表型百分率達(dá)到80%以上時(shí)方可繼續(xù)采用此細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 胃癌細(xì)胞株的培養(yǎng)：從液氮中取出BCG-823胃癌細(xì)胞株，經(jīng)復(fù)蘇后接種于GT-T551無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天觀察BCG-823胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況并適量補(bǔ)充培養(yǎng)基。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)γδ T細(xì)胞的增殖情況：取培養(yǎng)10 d且生長(zhǎng)狀態(tài)較好的γδ T細(xì)胞接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)基200 μL，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，加入2 μL不同濃度(濃度分別為0 μg/mL、0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL、10.000 μg/mL、20.000 μg/mL、40.000 μg/mL、80.000 μg/mL、100.000 μg/mL)的芝麻素誘導(dǎo)，設(shè)未加細(xì)胞及芝麻素組為空白組，0 μg/mL芝麻素為對(duì)照組，其余各濃度芝麻素組為實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入20 μL CCK-8液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素、CD107a的表達(dá)：取培養(yǎng)10 d的γδ T細(xì)胞接種于6孔板中，1×108個(gè)/孔，選取增殖效果較好的芝麻素濃度(濃度分別為0.156 μg/mL、0.313 g/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，收集細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后室溫下1 500 r/min離心5 min，重復(fù)2遍，每管分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的γδ T抗體、顆粒酶B單抗、穿孔素單抗、CD107a單抗 ，室溫下避光孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后室溫下1 500 r/min離心5 min，重復(fù)2遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素、CD107a的表達(dá)水平。

1.2.5 乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)γδ T細(xì)胞的殺傷活性：以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BCG-823細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，以經(jīng)不同濃度(分別為0 μg/mL、0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、 5.000 μg/mL、10.000 μg/mL)芝麻素誘導(dǎo)且在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后的γδ T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，其中0 μg/mL的芝麻素為對(duì)照組。調(diào)整靶細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，將效靶細(xì)胞按體積比為10 ∶1比例混合置于試管中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)管。500 r/min離心3 min后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，1 500 r/min離心10 min，吸取上清液，加入乳酸脫氫酶試劑后在生化分析儀上測(cè)定各管上清液的活性單位，計(jì)算γδ T細(xì)胞的殺傷活性。設(shè)經(jīng)各濃度芝麻素誘導(dǎo)后的γδ T細(xì)胞與BCG-823細(xì)胞混合的試管為測(cè)定管，只加BCG-823細(xì)胞與培養(yǎng)基的試管為靶細(xì)胞自然釋放管，只加γδ T細(xì)胞和培養(yǎng)基的試管為效應(yīng)細(xì)胞自然釋放管，BCG-823細(xì)胞與乙基苯基聚乙二醇溶液按體積比為10 ∶1混合的試管為靶細(xì)胞最大釋放管。γδ T細(xì)胞的殺傷活性=(測(cè)定管活性單位-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放管)/(靶細(xì)胞最大釋放管-靶細(xì)胞自然釋放管)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 γδ T細(xì)胞表型鑒定 培養(yǎng)前外周血中γδ T細(xì)胞百分率約為6.14%，培養(yǎng)10 d后外周血中γδ T細(xì)胞百分率高達(dá)90.34%，見圖1。

培養(yǎng)前 培養(yǎng)10 d后

2.2 不同濃度芝麻素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組的γδ T細(xì)胞增殖率均升高(P<0.05)，當(dāng)芝麻素濃度為1.250 μg/mL時(shí)γδ T細(xì)胞增殖率最高；而當(dāng)芝麻素濃度達(dá)到5.000 μg/mL以上時(shí)，對(duì)γδ T細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。見表1。

表1 不同濃度芝麻素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖率的影響(x±s，%)

2.3 不同濃度芝麻素對(duì)γδ T細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素和CD107a表達(dá)的影響 0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細(xì)胞的顆粒酶B表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，2.500 μg/mL芝麻組的表達(dá)水平最高。0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細(xì)胞的穿孔素表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，2.500 μg/mL芝麻組的表達(dá)水平最高。0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組 γδ T細(xì)胞的CD107a表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度芝麻素作用48 h后γδ T細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素及CD107a的表達(dá)水平(x±s，%)

2.4 不同濃度芝麻作用后γδ T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞BCG-823的殺傷活性 0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL芝麻素作用48 h后，γδ T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞BCG-823的殺傷活性均高于對(duì)照組(均P<0.05)，且在芝麻素濃度為2.500 μg/mL時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞BCG-823的殺傷活性最高，見表3。

表3 不同濃度芝麻素作用后γδ T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞BCG-823的殺傷活性(x±s，%)

3 討 論

研究證實(shí)，芝麻素具有抗氧化、清除自由基、改善脂代謝、降壓降糖、抗癌、殺菌、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)腎及神經(jīng)保護(hù)等功效[9-11]。近年來，國(guó)內(nèi)外研究均顯示芝麻素具有抗腫瘤特性，其可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[6,12-15]。凋亡是由基因調(diào)控下游死亡信號(hào)誘發(fā)的細(xì)胞主動(dòng)程序性死亡，而芝麻素可能通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、Caspase-8和Caspase-9等通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16-17]。

γδ T細(xì)胞是存在于人體黏膜組織的固有免疫細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)的功能及非特異性免疫的特性，對(duì)于人體維持免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[18]。隨著細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的成熟，γδ T細(xì)胞可單獨(dú)使用，或者與其他免疫細(xì)胞如記憶T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等聯(lián)合應(yīng)用治療多種腫瘤，且具有較好的療效[7,19]。γδ T細(xì)胞主要是通過主要組織相容性復(fù)合物，以非限制性的形式特異性識(shí)別腫瘤抗原，并釋放顆粒酶、穿孔素來殺傷腫瘤細(xì)胞[20]。γδ T細(xì)胞還可以通過自然殺傷細(xì)胞2族成員D與其配體的相互作用，殺傷具有相應(yīng)配體的腫瘤細(xì)胞[20]。此外，γδ T細(xì)胞還可通過穿孔素-顆粒酶途徑、Fas/Fas配體途徑，以及分泌腫瘤壞死因子α、γ-干擾素、IL-12等細(xì)胞因子，來發(fā)揮其抗腫瘤作用[21]。

學(xué)者們?cè)谌绾翁岣擀忙?T細(xì)胞的體外培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量和增強(qiáng)其殺傷功能方面進(jìn)行了很多研究，證實(shí)了IL-15、IL-21、CD28單克隆抗體等生物制劑和一些中藥單體成分可以增強(qiáng)γδ T細(xì)胞體外培養(yǎng)的擴(kuò)增效率及其抗腫瘤細(xì)胞毒活性[22-23]。芝麻素是一種木脂類中藥單體成分，但將其應(yīng)用于體外誘導(dǎo)擴(kuò)增γδ T細(xì)胞以及免疫治療，未見有研究報(bào)告。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組的γδ T細(xì)胞增殖率均升高(P<0.05)，而當(dāng)芝麻素濃度大于5.000 μg/mL時(shí)，對(duì)γδ T細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用，提示適當(dāng)濃度的芝麻素對(duì)γδ T細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，這為將芝麻素作為γδ T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細(xì)胞的顆粒酶B表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細(xì)胞的穿孔素表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組 γδ T細(xì)胞的CD107a表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL芝麻素作用48 h后γδ T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞BCG-823的殺傷活性均高于對(duì)照組(P<0.05),提示適宜濃度的芝麻素可能通過上調(diào)γδ T細(xì)胞中顆粒酶B-穿孔素通路及CD107a的表達(dá)，來增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性。

綜上所述，采用適宜濃度的芝麻素誘導(dǎo)人外周血γδ T細(xì)胞，可提高γδ T細(xì)胞的增殖率及殺傷胃癌細(xì)胞BCG-823的功能，機(jī)制可能與其上調(diào)γδ T細(xì)胞的顆粒酶B-穿孔通路和CD107a的表達(dá)有關(guān)。