張 卉 柴亮聽 盧 靜 王常燕 常文亮

(1 河北省邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，邯鄲市 056000，電子郵箱：huihui12302@163.com；2 河北省邯鄲市第一醫(yī)院檢驗科，邯鄲市 056000)

在體外受精-胚胎移植過程中，正常受精是通過在受精后16～18 h觀察到清晰的兩個原核(two pronuclei,2PN)來確認。然而，在實際臨床工作中有時會發(fā)現(xiàn)無原核(non-pronucleus,0PN)或單原核(single pronucleus,1PN)的合子，兩者的發(fā)生率分別為11.3%～20.0%[1]和1.6%～7.7%[2]。此類胚胎可能是未受精或異常受精的卵子，由于其存在染色體異常的風(fēng)險，歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會指南并不建議移植這些胚胎[3]。研究表明，部分0PN和1PN來源的胚胎為二倍體胚胎，具有正常的染色體結(jié)構(gòu)，有可能發(fā)育為類似2PN的正常胚胎[4-6]。目前，囊胚培養(yǎng)作為胚胎優(yōu)選的方法之一，已經(jīng)在生殖中心廣泛應(yīng)用。已有報道表明，移植0PN和1PN來源的卵裂期胚胎有較高的流產(chǎn)率和較低的妊娠率，但移植囊胚期胚胎能夠得到與2PN來源囊胚類似的臨床妊娠結(jié)局[7-9]。雖然有關(guān)0PN及1PN胚胎移植后妊娠結(jié)局的研究報道很多，但關(guān)于健康嬰兒出生和新生兒隨訪的文獻報道并不多。本文回顧性分析常規(guī)體外受精(conventionalinvitrofertilization，c-IVF)中0PN和1PN來源凍融單囊胚移植的妊娠結(jié)局及新生兒情況，為了解0PN和1PN來源胚胎的臨床應(yīng)用效果、提高胚胎利用率、制定臨床移植策略提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2015年12月至2019年6月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科實施凍融單囊胚移植的255例不孕癥患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：c-IVF周期中有0PN、1PN和2PN來源囊胚，且冷凍解凍后囊胚存活并移植的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療、卵裂期胚胎移植及移植后失訪的患者。每對夫婦在充分了解0PN和1PN胚胎在體外受精-胚胎移植過程中相關(guān)的潛在問題后，簽署書面知情同意書。

1.2 實驗室策略 采用本中心常規(guī)長方案、短方案進行控制性卵巢刺激[10]，當(dāng)3個卵泡直徑≥18 mm時，給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)5 000～10 000 IU(珠海麗珠制藥)，35～37 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵并用c-IVF方式受精。取卵當(dāng)日，男方手淫取精，使用梯度離心法和上游法處理精子，按照6～8個卵、10萬～20萬條精子/mL的比例在雙井皿中進行受精。在6% CO2、5% O2和89% N2的環(huán)境中進行胚胎培養(yǎng)。加入精子16～18 h后，在倒置顯微鏡下觀察卵子原核和極體，確認受精情況。觀察受精卵，存在2個明顯不同的原核和2個極體的合子為2PN，只有1個原核和兩個極體的合子為1PN，沒有原核和存在2個極體的合子為0PN。第3天可利用胚胎定義為細胞數(shù)≥6個、細胞碎片比例≤25%的2PN胚胎。除外第3天移植及冷凍的2PN胚胎，將剩余2PN胚胎及所有1PN和0PN卵裂期胚胎進行囊胚培養(yǎng)。參照Gardner等[11]提出的囊胚分級系統(tǒng)，根據(jù)囊胚腔擴張程度、內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞質(zhì)量對囊胚進行評分；本中心可利用囊胚的定義為擴張度≥3期且內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞至少一項優(yōu)于C級的囊胚。

1.3 胚胎冷凍保存及凍融囊胚移植 本研究選用c-IVF后第5天或第6天的可利用囊胚進行冷凍保存，0PN、1PN、2PN來源囊胚的冷凍標(biāo)準(zhǔn)均相同。通過玻璃化冷凍的方法進行冷凍和解凍，按照玻璃化冷凍、解凍試劑盒(日本Kitazato公司，冷凍液、解凍液批號分別為：VT101、VT102)操作說明書進行操作。所有囊胚解凍后立刻接受激光削除1/4周透明帶輔助孵化，見圖1。3組患者采用自然周期或人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜：(1)自然周期。于患者月經(jīng)周期第8～10天采用經(jīng)陰道B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，當(dāng)卵泡直徑>14 mm時，注意監(jiān)測黃體生成素、雌二醇、孕酮水平，排卵后第5天行凍融單囊胚移植。(2)人工周期。月經(jīng)第3天起口服戊酸雌二醇(補佳樂，德國拜耳公司)，第3～6天為2 mg/次，2次/d；第7～11天為3 mg/次，2次/d；之后根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整用藥劑量及時間。當(dāng)內(nèi)膜厚度達到8 mm及以上、雌二醇>200 pg/mL時，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)，第1～2天為40 mg/d，1次/d；第3～6天為60 mg/d，1次/d，并于第6天行凍融單囊胚移植。當(dāng)進行胚胎移植時，不論胚胎級別如何，均優(yōu)先考慮移植2PN來源囊胚，在患者充分知情同意后，可將1PN和0PN囊胚移植入無2PN胚胎的患者子宮內(nèi)，最終分別有27例、19例、209例患者移植0PN、1PN、2PN胚胎，分別記為0PN組、1PN組和2PN組。移植后繼續(xù)給予黃體支持，使用黃體酮60 μg/d肌肉注射或黃體酮凝膠(瑞士默克雪蘭諾公司)90 mg/d陰道給藥，直至移植14 d后檢測血β-hCG。

圖1 凍融囊胚透明帶示意圖(×20)

1.4 妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的評估 (1)妊娠結(jié)局：記錄3組患者的著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率。患者移植后14 d查血β-hCG水平，β-hCG≥3 mU/mL為陽性，28 d行B超檢查，有孕囊者為臨床妊娠，異位妊娠亦記為臨床妊娠；早期流產(chǎn)為孕12周內(nèi)的自然流產(chǎn)；持續(xù)妊娠為宮內(nèi)妊娠持續(xù)超過12周。(2)新生兒結(jié)局：參與調(diào)查的夫婦在妊娠的每個階段均進行電話隨訪。記錄3組患者活產(chǎn)率以及新生兒出生時孕周、出生時體重、性別、先天畸形的情況，其中新生兒先天畸形定義為起源于胚胎期和胎兒期的發(fā)育異常。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)或M(Q)表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析或非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組患者基礎(chǔ)資料的比較 3組患者均行單囊胚移植。3組患者的年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)、移植前內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜方案比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 3組患者基礎(chǔ)資料的比較

2.2 3組患者妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的比較 1PN組的胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率均低于其他兩組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；2PN、1PN組的早期流產(chǎn)率較0PN組高，其中1PN組最高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2PN組患者臨床妊娠中有2例為異位妊娠，均為左側(cè)輸卵管間質(zhì)部妊娠，3組的異位妊娠率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。1PN組的活產(chǎn)率均低于其他兩組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；其中2PN組有1例孕20+2周因羊水過少使用縮宮素自然分娩后胎兒死亡，98名活嬰兒出生中1名出生7 d后因不明原因腹瀉住院，治療無效死亡。3組的新生兒出生時孕周、出生時體重和性別構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，3組均無先天畸形嬰兒出生。見表2。

表2 3組患者妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的比較

組別n活產(chǎn)胎兒數(shù)活產(chǎn)率新生兒出生時孕周(x±s,周)新生兒出生時體重(x±s,g)男性/女性(n)重大先天畸形兒(n)0PN組271348.15%(13/27)38.65±2.423 071.31±556.695/801PN組19526.32%(5/19)38.12±1.903 518.00±455.213/202PN組2099846.89%(98/209)38.54±1.693 374.18±566.9852/460 F/χ2值—3.0590.1701.908——P值—0.2170.8440.1530.608*—

3 討 論

原核形成是受精成功的標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)2PN是正常受精的標(biāo)志。但在輔助生殖技術(shù)中，還可以觀察到多原核(≥3PN)、1PN或者0PN的異常受精情況。一般認為，此類胚胎不適合進行移植。但臨床研究顯示，0PN和1PN來源的胚胎中也存在正常受精的胚胎，這些胚胎染色體正常，能夠發(fā)育為形態(tài)正常的胚胎[9，12]。有研究表明，在沒有2PN來源胚胎時，可以考慮移植0PN、1PN來源囊胚，可獲得與2PN囊胚相似的妊娠結(jié)局[13-14]。而多原核常見于多精受精，此類胚胎有染色體多倍體的風(fēng)險，目前不建議繼續(xù)培養(yǎng)。 0PN形成的原因可能是原核未形成、原核消失或未受精的卵子。在原核未形成或原核消失的情況下，受精過程可能是正常的，但細胞周期可能比平?？旎蚵虼藷o法確認原核的存在。一般來說，在成熟的卵子中，原核在授精后16～18 h出現(xiàn)。一項ICSI后的延時觀察研究顯示，原核最晚可在精子注射30.14 h后出現(xiàn)，最早可在注射后的6.16 h消失[15]。這表明，在授精16～18 h內(nèi)未觀察到原核，可能是由于確認受精時原核消失或尚未出現(xiàn)。然而，在大多數(shù)正常受精胚胎中，原核在授精后16～18 h不會消失。Nagy等[16]觀察發(fā)現(xiàn)在授精16 h后99%(92/93)的2PN胚胎仍可見原核。在本研究中，0PN胚胎可能包括觀察受精時原核已消失的胚胎或原核尚未形成的胚胎，但這種胚胎的比例很小。1PN的形成可能是由于：原核形成和/或原核消失的時間不恰當(dāng)[17]；早期原核破裂或原核融合；父系或母系染色質(zhì)的單性生殖發(fā)育。單性生殖發(fā)育可導(dǎo)致單倍體細胞，而前兩種原因所形成的1PN可發(fā)育為正常的染色體數(shù)，因此，即使在1PN胚胎中也可能存在具有正常染色體數(shù)目的胚胎。有研究表明，1PN胚胎可以發(fā)育為正常的胚胎，并產(chǎn)生健康的后代[12，18-19]。

有研究顯示，胚胎發(fā)育至融合階段形成囊胚，胚胎基因組激活，能夠發(fā)育至囊胚階段的胚胎染色體異常率低，囊胚培養(yǎng)可以有效地從0PN和1PN來源的胚胎中選擇染色體正常的胚胎，并用于新鮮周期或冷凍保存后的凍融周期移植[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，進行冷凍解凍卵裂期胚胎移植時，0PN、1PN來源胚胎的植入率均顯著低于2PN源性胚胎，然而進行囊胚移植時，3種胚胎的植入率差異并無統(tǒng)計學(xué)意義[8-9]。因此，本中心將0PN、1PN卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)至第5～6天，觀察其囊胚形成情況，將達到標(biāo)準(zhǔn)的囊胚進行冷凍，結(jié)果顯示，通過c-IVF方式獲得的0PN來源囊胚的妊娠結(jié)局與2PN來源囊胚相似，1PN來源囊胚的臨床妊娠率及活產(chǎn)率低于0PN囊胚與2PN囊胚來源，但差異也并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這表明在c-IVF周期中0PN、1PN來源的凍融囊胚可獲得與2PN來源凍融囊胚相似的助孕結(jié)局，因此0PN與1PN來源囊胚仍具有一定的臨床移植價值。但Liao等[20]研究報告，通過囊胚培養(yǎng)雖然可以篩選出單倍體胚胎，但不能消除嵌合體胚胎和多倍體胚胎。這表明僅根據(jù)1PN或0PN卵裂期胚胎是否能發(fā)育至囊胚期，并不能保證胚胎的安全性。有條件的生殖中心可將異常受精(0PN、1PN)來源的囊胚進行植入前基因檢測后進行冷凍或移植以保證其移植的安全性。此外，胚胎發(fā)育是一個漫長且復(fù)雜的過程，不僅可能受實驗室因素的影響，而且還可能受患者因素的影響。從實驗室的角度看，培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度和pH值是胚胎發(fā)育最重要的影響因素[21]，上述所有的變量都可能會影響受精評估結(jié)果，進而影響胚胎的進展和發(fā)育。因此，在實際工作中，評估0PN及1PN來源胚胎是否適合移植需考慮多種因素。

本研究中，0PN、1PN囊胚解凍移植后分別有13名、5名健康嬰兒出生，并未發(fā)現(xiàn)存在先天畸形，這表明部分0PN、1PN來源胚胎是正常的，可以應(yīng)用于臨床移植。因此，在c-IVF周期中，當(dāng)患者因2PN胚胎質(zhì)量差無法移植或無2PN來源可利用胚胎時，0PN或1PN來源囊胚可作為備選胚胎進行移植。然而，1PN和0PN來源的胚胎移植并不常見，本研究中接受此類胚胎移植的受試者數(shù)量有限，因此無法評估使用這些胚胎的安全性。對于選擇這一方案進行移植的患者，都必須給予充分的知情同意權(quán)。盡管在本研究中沒有觀察到先天畸形兒出生，但還需要進一步的詳細研究，以探討0PN、1PN來源胚胎移植的安全性。

綜上所述，常規(guī)體外受精中形態(tài)正常的0PN、1PN囊胚有較好的發(fā)育潛能，在無2PN來源胚胎且患者充分知情同意的情況下可以考慮移植，但需嚴密隨訪臨床妊娠過程及結(jié)局。