不同病態(tài)竇房結(jié)綜合征造模方法對(duì)SAN結(jié)構(gòu)、功能的影響

畢路甲，付升旗

摘要：目的：不同病態(tài)竇房結(jié)綜合征造模方法對(duì)竇房結(jié)（SAN） 解剖位置、組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)及起搏相關(guān)離子通道功能的影響。方法：將36只兔隨機(jī)分成假手術(shù)組、甲醛濕敷組和甲醛滴注組，每組12只。甲醛濕敷組兔采用甲醛濕敷法進(jìn)行建模;甲醛滴注組兔采用甲醛滴注法進(jìn)行建模;假手術(shù)組僅打開胸腔，剪開心包膜，不進(jìn)行甲醛濕敷或甲醛滴注。HE染色觀察SAN組織形態(tài)變化。采用心房調(diào)搏法測(cè)量造模前及造模后1 h的竇房傳導(dǎo)時(shí)間（SACT） 、竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRT） 、校正竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRTc） 。采用心房調(diào)搏法測(cè)量造模前及造模后1 h的竇房傳導(dǎo)時(shí)間（SACT） 、竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRT） 、校正竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRTc） 。Western blot檢測(cè)SAN組織超極化激活環(huán)核苷酸門控非選擇性陽(yáng)離子通道（HCN4） 蛋白。結(jié)果：甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異不明顯（P > 0.05） 。甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT高于甲醛濕敷組（P < 0.05） 。甲醛滴注組HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)低于甲醛濕敷組（P < 0.05）。結(jié)論：甲醛濕敷法建立兔SAN損傷模型優(yōu)于甲醛滴注法。

關(guān)鍵詞：病態(tài)竇房綜合征;竇房結(jié);組織細(xì)胞形態(tài)學(xué);離子通道

竇房結(jié)（SAN） 是各種哺乳動(dòng)物心臟右心房上的一個(gè)特殊的小結(jié)節(jié)，能啟動(dòng)和調(diào)控心臟節(jié)律。病態(tài)竇房結(jié)綜合征簡(jiǎn)稱病竇綜合征或病竇，又稱竇房結(jié)功能障礙，是由竇房結(jié)病變而引起的一組由癥狀組成的心血管疾病[1～2]。對(duì)于明確診斷為病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者，無(wú)論是內(nèi)科保守治療還是外科手術(shù)介入治療，臨床患者都會(huì)受到一系列并發(fā)癥的威脅，嚴(yán)重者可發(fā)生阿斯綜合征導(dǎo)致暈厥，甚至猝死[3]。在探討病態(tài)竇房結(jié)綜合征治療方法過(guò)程中，一個(gè)重要的研究手段是在動(dòng)物身上復(fù)制SAN功能損傷模型。目前多采用手術(shù)方法或者藥物方法建立竇房結(jié)功能損傷模型，然而對(duì)某一個(gè)體動(dòng)物模型不同方式的建立對(duì)SAN以及起搏相關(guān)離子通道功能的影響尚無(wú)研究報(bào)道。本文采用甲醛濕敷法和甲醛滴注法對(duì)兔進(jìn)行SAN損傷建模，比較兩種不同建模方式對(duì)SAN組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)及起搏相關(guān)離子通道功能的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超級(jí)化激活的環(huán)核苷酸陽(yáng)離子通道（HCN1） 、HCN2、HCN3、HCN4抗體以及相應(yīng)的二抗購(gòu)于Santa Cruz公司;RNA提取試劑TRIzol及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購(gòu)自武漢極捷生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自金克隆（北京） 生物技術(shù)有限公司;ECL發(fā)光液購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)于北京安麥格貿(mào)易有限公司;烏拉坦購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;B203LED 型生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司） ;DF-5A 型心臟電生理刺激儀（蘇州市東方電子儀器廠） ;BL420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司） 。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)兔36只，雌雄各半，體重2.02～3.58 kg，購(gòu)于吉林和元生物工程股份有限公司;許可證號(hào)：SYXK（吉） 2021-0004。將普通級(jí)兔隨機(jī)分成甲醛濕敷組、甲醛滴注組和假手術(shù)組，每組12只。所有家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。甲醛濕敷組兔采用甲醛濕敷法進(jìn)行建模，甲醛滴注組兔采用甲醛滴注法進(jìn)行建模。假手術(shù)組所有兔僅打開胸腔，剪開心包膜，不進(jìn)行甲醛濕敷或甲醛滴注。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病態(tài)竇房綜合征模型建立

所有兔經(jīng)耳緣靜脈注射 20 % 烏拉坦 4 ～5 mL/ kg 麻醉后固定，連接體表心臟Ⅱ?qū)А５谌吖撬綖橹行膫淦?、消毒后沿胸骨正中偏?2 ～3 mm 縱行切開胸腔，暴露右心房，用注射器連接套管，深入心包膜腔內(nèi)側(cè)，輕輕吸取心包液。

濕敷法：用干棉簽輕放于右心耳處，輕輕將心臟撥向左側(cè)，暴露右心房與上腔靜脈交界（SAN區(qū)） ，用40 %甲醛將棉簽底部充分浸潤(rùn)，輕輕送至SAN區(qū)，濕敷3～5 min。當(dāng)心率較濕敷前下降 30 %以上或出現(xiàn)竇性停搏、竇房阻滯或結(jié)性逸搏時(shí)取出棉簽，觀察心律變化情況。對(duì)未出現(xiàn)上述心律失常者則持續(xù)濕敷，并繼續(xù)觀察心律情況。

滴注法：將自制標(biāo)測(cè)電極一端連接于心臟V1導(dǎo)聯(lián)，另一端放置于竇房結(jié)區(qū)，標(biāo)測(cè)竇房結(jié)電圖，并固定位置，然后將自制標(biāo)測(cè)電極末端接上裝有40 %甲醛的微量注射器，彈丸樣緩慢推注。當(dāng)心率下降30 %以上或出現(xiàn)竇性停搏、竇房阻滯或結(jié)性逸搏時(shí)暫停推注，觀察心律變化情況。對(duì)未出現(xiàn)上述心律失常者則持續(xù)推注，最大量至0. 03 mL。

1.3.2 SAN組織形態(tài)觀察

按在建模1周后對(duì)兔進(jìn)行麻醉、開胸、暴露心臟，去SAN組織制備標(biāo)本。將切取的竇房結(jié)組織經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后立即置入4 %多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋及HE染色，在光鏡下觀察竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.3.3 檢測(cè)SAN功能指標(biāo)

采用心房調(diào)搏法測(cè)量造模前及造模后1 h的竇房傳導(dǎo)時(shí)間（SACT） 、竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRT） 、校正竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間（SNRTc） 。比較各組模型兔造模前后SACT、SNRT和SNRTc。

（1） 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)（RT-PCR） 檢測(cè)HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA表達(dá)：采用Trizol法提取SAN組織中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA的濃度。以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并置于4℃保存，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，置于RT-PCR儀（CFX96型，美國(guó)bio-radBiorad公司） 中進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃，5 min預(yù)變性;95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火35 s，65 ℃延伸 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。以β-action為內(nèi)參，引物序列如下：HCN1：上游序列：5′-TGGTGGCTACAATGCCTTTA-3′，下游序列：5′-TTCCTCCGGGACCTCGTT-3′ ;HCN2：上游序列：5′-CGTTACCAGGGCAAGATGTTT-3′，下游序列：5′-GTTGTCCACGATCAGCGAAT-3′;HCN3：上游序列：5′-TCTCCGACACCTTCT。TTCTGC-3′，下游序列：5′-CCCACTGGTGTATGTAGCGG-3′;HCN4：上游序列：5′-GTACTCCTACGCGCTCTTCA-3′，下游序列：5′-GCTCTCCTCGTCGAACATCT-3′;β-action：上游序列： 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用 2-ΔΔCT 法對(duì)統(tǒng)計(jì)HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

（2） Western blot檢測(cè)起搏相關(guān)蛋白：取左心室SAN區(qū)心肌組織，裂解以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，提取心肌組織蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度;凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜;5 %脫脂奶粉封閉孵育2 h，添加相應(yīng)的一抗和二抗，選擇GAPDH作為內(nèi)參，使用ECL法顯示蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用[n（%） ]表示，χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α = 0.05，以雙側(cè)P < 0.05時(shí)，說(shuō)明該數(shù)據(jù)具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SAN損傷模型兔SAN變化

與假手術(shù)組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組可見SAN細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，部分粒細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維組織增生。甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異不明顯（P > 0.05） 。

2.2 不同損傷模型兔SAN功能比較

三組兔造模前SNRT、SNRTc和SACT比較無(wú)明顯差異。造模后，與假手術(shù)組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT明顯上升（P < 0.05） ，且甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT明顯高于甲醛滴注組（P < 0.05） 。見表1。

2.3 不同損傷模型兔SAN區(qū)HCN1、HCN2、HCN3和HCN4mRNA表達(dá)

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醛濕敷組和甲醛滴注組主要以HCN4 mRNA表達(dá)為主，少量HCN1、HCN2表達(dá)，未檢出HCN3 mRNA 表達(dá)。甲醛濕敷組和甲醛滴注組HCN4 mRNA分別為（0.86±0.09） 、（0.63±0.07） 明顯低于假手術(shù)組HCN4 mRNA表達(dá)（1.02±0.01） ，且甲醛濕敷組HCN4 mRNA表達(dá)低于甲醛滴注組HCN4 mRNA表達(dá)（P < 0.05） 。

2.4 不同損傷模型兔SAN區(qū)HCN4蛋白表達(dá)

甲醛濕敷組和甲醛滴注組HCN4蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組，且甲醛濕敷組HCN4蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于甲醛滴注組HCN4蛋白相對(duì)表達(dá)水平（P < 0.05） 。見圖1。

3 討論

SAN呈非特異性退行性纖維變性，是導(dǎo)致病態(tài)竇房結(jié)綜合征的重要因素[4]。在該病變過(guò)程中起搏細(xì)胞逐漸被纖維組取代，從而導(dǎo)致SAN起搏細(xì)胞的直接減少，其正常起搏功能逐漸減退[5]。這些起搏細(xì)胞擁有特殊的離子通道流的組合，當(dāng)SAN受到損傷時(shí)，這些起搏細(xì)胞原有的功能會(huì)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致嚴(yán)重的心動(dòng)過(guò)緩、高度房室傳導(dǎo)阻滯等心律失常的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，甲醛濕敷組和甲醛滴注組可見SAN細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，可見部分粒細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維組織增生，但甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異不明顯，說(shuō)明甲醛濕敷和甲醛滴注均可對(duì)兔SAN區(qū)造成一定的損傷。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT明顯上升，且甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT上升幅度明顯大于甲醛滴注組。甲醛滴注法利用SAN損傷電圖的特異性，角度新穎，同時(shí)對(duì)兔產(chǎn)生的創(chuàng)傷較小，但SAN電圖測(cè)量困難，容易受到自身或外界其他因素影響，使得造模損傷程度無(wú)法控制。甲醛濕敷法雖然對(duì)兔創(chuàng)傷大，但便于控制模型的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT下降幅度明顯大于甲醛滴注法，分析其原因可能是因?yàn)樾呐K表面光滑，不易于甲醛吸附在心臟表面，導(dǎo)致SAN損傷程度不足造成，其具體原因需進(jìn)一步研究分析。本研究分析不同建模方式對(duì)起搏相關(guān)離子通道功能的影響發(fā)現(xiàn)，甲醛濕敷組和甲醛滴注組均以HCN4表達(dá)為主，少見HCN1、HCN2表達(dá)，且甲醛濕敷組HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于甲醛滴注組。HCN是一種環(huán)總超家族陽(yáng)離子通道，主要存在于細(xì)胞膜上，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的SAN功能障礙[6]。既往研究顯示[7]，SAN免疫組化染色顯示HCN4表達(dá)位于結(jié)中央?yún)^(qū)，向周邊逐漸減少，甲醛加壓注射滲透法建立兔SAN組織損傷模型后，兔SAN組織HCN4蛋白表達(dá)有不同程度的下降。本研究結(jié)果說(shuō)明，兩種SAN損傷建模方式對(duì)HCN4通道均有影響，但甲醛濕敷組影響較大，可能與其對(duì)SAN造成的損傷程度有關(guān)。

綜上所述，甲醛濕敷法建立兔SAN損傷模型優(yōu)于甲醛滴注法。一個(gè)理想的制造病態(tài)竇房綜合征模型試劑，首先必須能對(duì)作用區(qū)域的心肌細(xì)胞造成一定程度的損傷。其次，其作用范圍及程度可控，不致使藥液作用范圍過(guò)大而損傷正常心肌組織。

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