劉松鴿，王軍凱，李曉娜，張發(fā)順

（河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院病理科，河南 許昌 461000）

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]，并且發(fā)病年齡逐漸年輕化[2]。目前，甲狀腺癌的治療以外科手術(shù)為主，輔助放療和化療。影響甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的因素較為復(fù)雜，臨床迄今尚無(wú)公認(rèn)的腫瘤免疫學(xué)指標(biāo)或者基因?qū)W標(biāo)記對(duì)判斷其預(yù)后[3]。因此，甲狀腺癌標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)于該疾病的早期診治及預(yù)后判斷具有積極意義。白細(xì)胞介素17 受體D （interleukin-17 receptor D，IL17RD），又被稱為人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似表達(dá)基因,其可能通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和MAP 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1）是一種可溶性的蛋白多糖，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7,8]。LIN52 是轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)基因基因家族成員之一，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞的增殖與分化、腫瘤生長(zhǎng)的血管系統(tǒng)的形成等生理或病理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。本研究旨在探討IL17RD、ESM-1 和LIN52 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為甲狀腺癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取 2014 年 1 月-2016 年 11 月于本院行手術(shù)治療的125 例甲狀腺癌患者為研究對(duì)象，其中男性 73 例，女性 52 例，年齡 35～79 歲，平均年齡63.84±6.49 歲。根據(jù)病理類型的不同分為甲狀腺乳頭狀癌 （47 例）、 濾泡狀甲狀腺癌（36例）、髓樣甲狀腺癌（28 例）和未分化癌（14 例）；根據(jù)TNM 分期分期不同，Ⅰ期19 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期49 例，Ⅳ期31 例；根據(jù)分化程度不同，高分化31 例，中分化 39 例，低分化 55 例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有51 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他腫瘤患者；⑵合并心臟、肝、腎等重要器官障礙者；⑶合并自身免疫系統(tǒng)疾病患者。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療等治療。

本研究經(jīng)本院倫理醫(yī)學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者或其家屬知情同意并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)組織中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 表達(dá)水平 應(yīng)用 RNA提取試劑盒（德國(guó)Qingen 公司）提取甲狀腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。應(yīng)用Quanti Tect 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s,共 35 個(gè)循環(huán)。IL17RD 上游 5' -FACATAAACAGTCTCAAAC TCGCAC-3'，下游 5'-CTGATCCTAAAGCCCTTACAACTAA-3'；LIN52 上游 5'-GTTTACCTGA AGAGCTCTGGTAC-3',下游 5'-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT -3'；ESM 上 游 5' -ACTAT GCTGAAGTCTTAGGA-3', 下游 5'-TCAGAACTG AGTAAGGCCTG-3'；GAPDH 上 游 5'-GAT TGTT GCCATCAACGACC-3',下游 5'-GTGCAGGATGCA TTGCTGAC-3'。以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 2－△△Ct法計(jì)算組織中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中IL17RD、LIN52和ESM-1 蛋白表達(dá) 組織采用石蠟包埋、 切片機(jī)切取組織，厚度5mm。將切片置于60℃恒溫箱中烘烤60min 后，30%雙氧水進(jìn)行脫蠟處理。蒸餾水清洗后，微波抗原修復(fù)。切片自然冷卻后，PBS 洗滌3次，每次 3min。5% BSA 室溫封閉 20min。滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌 3 次，每次 3min。滴加二抗，37℃孵育 30min。滴加 DAB 顯色試劑，流水沖洗干凈，蘇木精復(fù)染2min，頸托稅后樹(shù)膠封固，鏡檢。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)以及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：⑴染色強(qiáng)度：無(wú)色記為0 分，淡黃色記為1 分，棕黃色記為2分，褐色或黑色記為3 分；⑵陽(yáng)性細(xì)胞比例：＜10%記為 1 分，10%～50%記為 2 分，51%～75%記為 3分，＞75%記為 4 分。兩種分?jǐn)?shù)的乘積≤3 分為陰性，＞3 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。兩組間比較采用t 檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的mRNA 表達(dá)水平 與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52和ESM-1 的mRNA表達(dá)水平

2.2 甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率 甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)均主要定位于細(xì)胞質(zhì)。與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 免疫組化染色結(jié)果

表2 甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

2.3 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 表達(dá)與甲狀腺癌患者年齡、性別、腫瘤直徑以及病理類型無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），與 TNM 分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的相關(guān)性（P＜0.05），并且TNM 分期越高、分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率越高。結(jié)果如表3 所示。

2.4 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者 3 年生存率均顯著低于陰性表達(dá)患者(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表3 IL17RD、LIN52 和ESM-1 表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白表達(dá)生存曲線

2.5 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析 Cox 回歸分析顯 示，IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)均是影響甲狀腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率。甲狀腺癌的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響,其發(fā)生可通過(guò)增加遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者病死率增加[10]。目前，臨床缺乏有效的早期診斷甲狀腺癌的方式，尋找用于早期診斷甲狀腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于甲狀腺癌的早期治療以及改善預(yù)后具有重要意義。

表4 Cox回歸分析甲狀腺癌預(yù)后影響因素

IL17RD 與其配體IL-17 不僅在炎癥反應(yīng)中起重要作用，還參與腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展[11,12]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中IL17RD 的mRNA 和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，其陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部浸潤(rùn)等臨床病理特征具有明顯相關(guān)性，與劉美宏等[13]報(bào)道的結(jié)果一致。本研究還顯示，IL17RD 陽(yáng)性表達(dá)的患者3 年生存率低于陰性表達(dá)患者，實(shí)影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明IL17RD參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，原因可能與IL17RD 表達(dá)升高促進(jìn)成纖維生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成有關(guān)[14]，提示IL17RD 可作為甲狀腺癌診治和預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)記物。

ESM-1 主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,是腫瘤內(nèi)皮組織血管侵襲的生物標(biāo)志物。羅雪慧等[15]研究顯示, 子宮內(nèi)膜腺癌組織中ESM-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織,與子宮內(nèi)膜病變程度密切相關(guān)，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ESM-1 在甲狀腺癌組織中的mRNA 水平以及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織,其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨腫瘤分期逐級(jí)遞增，隨分化程度高、中、低逐漸遞增，隨有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移依次遞減，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[16]，提示ESM-1 可能與甲狀腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲等息息相關(guān)。

作為轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)基因基因家族成員，LIN52基因可調(diào)控白細(xì)胞介素 8（IL-8）和 VEGF，LIN52蛋白高表達(dá)的淋巴細(xì)胞能夠分泌更多的IL-8 和VEGF，參與炎癥反應(yīng)及腫瘤血管生成[17]。Luo 等[18]研究顯示，胃癌組織中LIN52 的mRNA 表達(dá)水平升高，LIN52 高表達(dá)的患者對(duì)化療敏感性低于低表達(dá)患者，可能是胃癌診治和預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中LIN52 的mRNA 和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，并且甲狀腺癌TNM 分期越高、腫瘤分化程度越低、 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及出現(xiàn)局部浸潤(rùn)時(shí)，LIN52 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高，說(shuō)明LIN52 參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其與甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲等密切相關(guān)，原因可能是高表達(dá)LIN52 的腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力更強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞需要與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合才能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)層[19,20]。

綜上所述，甲狀腺癌組織中IL17RD、LIN52、ESM-1 的mRNA 和蛋白均呈高表達(dá)，可作為甲狀腺癌預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)。