張 紅， 黃志銀， 李 梅， 范偉強(qiáng)， 華德平， 王超楠

(1.天津科潤(rùn)蔬菜研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300381；2.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300354)

青麻葉大白菜(BrassicacampestrisL. ssp. pekinensis)是天津地區(qū)的特色種質(zhì)資源，它對(duì)不良的氣候和土壤條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，耐冬季儲(chǔ)運(yùn)，加之外形直順，口感佳，一直是京津地區(qū)人民餐桌上不可缺少的蔬菜之一。近年來，由于青麻葉等大白菜栽培效益好，復(fù)種指數(shù)高，市場(chǎng)范圍逐漸擴(kuò)大，但一種世界性土傳病害根腫病的發(fā)生嚴(yán)重限制了青麻葉大白菜的安全生產(chǎn)。根腫病由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害大白菜等十字花科蔬菜，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)有20多個(gè)省、市、自治區(qū)都存在十字花科作物根腫病發(fā)病的情況，且發(fā)病面積不斷增加，有1/3以上的十字花科作物種植區(qū)受到根腫病的侵染，其中西南地區(qū)和中部地區(qū)最為嚴(yán)重[1-3]。但試驗(yàn)證明，青麻葉大白菜中缺乏對(duì)根腫病的抗性[4]，在云南、湖北等病害高發(fā)地區(qū)青麻葉的栽培極易受到損害[5-7]。因此，隨著我國(guó)根腫病發(fā)病區(qū)域越來越廣、病情越來越嚴(yán)重，亟需選育出抗根腫病的青麻葉大白菜。

傳統(tǒng)的抗病育種手段僅依靠田間表型和育種經(jīng)驗(yàn)，不但會(huì)受到主觀意識(shí)的影響，而且由于存在連鎖累贅，當(dāng)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳物質(zhì)通過表型無法表現(xiàn)出來時(shí)，將降低篩選的效率，此外，傳統(tǒng)田間育種周期長(zhǎng)，工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)地，弊端明顯。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)(Marker Assisted Selection，MAS)相較于傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)育種，大大縮短了新品種的選育周期，既降低了選育過程中的工作量，也能從基因水平上確保篩選的準(zhǔn)確性。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)也逐漸被國(guó)內(nèi)外育種家廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、白菜等作物中[8-12]，但針對(duì)天津特色種質(zhì)資源青麻葉大白菜的抗根腫病育種研究尚存在空白，加之國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)分子標(biāo)記輔助育種的研究多專注于標(biāo)記的挖掘及開發(fā)，針對(duì)篩選效率的研究相對(duì)缺乏。本研究旨在通過探究影響篩選效率的幾個(gè)重要因素，提高選育效率，以期構(gòu)建一套快速高效的抗根腫病青麻葉近等基因系體系，不僅有助于快速選育出性狀優(yōu)良、抗性佳的種質(zhì)資源，同時(shí)對(duì)提升天津市大白菜分子育種水平具有重要研究意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材來源：G 57含有根腫病抗性基因CRb，被作為供體親本材料；H 227是具有優(yōu)良性狀的青麻葉大白菜，但缺乏根腫病抗性基因，被作為輪回親本。兩試驗(yàn)材料均由天津科潤(rùn)蔬菜研究所大白菜課題組提供。

菌株來源：供試菌株采集自湖北長(zhǎng)陽(yáng)賀家坪的大白菜發(fā)病腫根中，該菌經(jīng)Williams方法鑒定為致病性強(qiáng)的4號(hào)生理小種[13-15]，菌株取回后洗凈干燥處理，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1分子標(biāo)記的前景選擇及背景選擇

前景選擇：首先將G 57中開發(fā)的分子標(biāo)記Bra 0235-2和Bra 19317在抗感雙親G 57和H 227中進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，具有穩(wěn)定多態(tài)性則作為前景選擇，用于各回交世代篩選兼具抗病帶型的單株進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育。

背景選擇：首先選擇覆蓋大白菜全基因組的分子標(biāo)記[16-17]在親本間進(jìn)行多態(tài)性分析。然后從多態(tài)性標(biāo)記中篩選出均勻分布于大白菜基因組的分子標(biāo)記，應(yīng)用于BC1F1群體及其以后世代的基因組背景分析。根據(jù)基因組背景分析，在每個(gè)世代選擇輪回親本基因組含量高的單株用于回交或自交，最后獲得兼具抗根腫病和輪回親本優(yōu)良性狀的近等基因系。

1.2.2供試群體數(shù)對(duì)標(biāo)記篩選效率的影響

2018年秋季，在武清基地育苗棚將試材播種于72孔穴盤培養(yǎng)，從BC1F1代的一個(gè)群體中隨機(jī)選擇5,9,18,27,36株進(jìn)行分子標(biāo)記的篩選，每個(gè)樣本量重復(fù)3次，出苗后采集葉片，確定用于各回交世代的最佳供試群體數(shù)。

1.2.3分子標(biāo)記背景選擇的最初世代對(duì)篩選效率的影響

試材同樣播種于武清基地育苗棚，在其他條件相同的情況下，分別對(duì)BC1F1、BC2F1、BC3F1群體的入選單株進(jìn)行分子標(biāo)記背景選擇，每個(gè)處理重復(fù)3次，對(duì)背景回復(fù)率進(jìn)行分析，確定開展分子標(biāo)記背景選擇的最佳世代。

2019年3月，將種子播種到育苗盤中，正常管理，育苗培養(yǎng)30 d后，待幼苗長(zhǎng)到5～6片真葉時(shí)取樣，采集葉片2～3片保存于-40 ℃，用于DNA提取。分子試驗(yàn)在天津科潤(rùn)蔬菜研究所分子實(shí)驗(yàn)室開展。

1.2.4大白菜基因組DNA提取及SSR分析

DNA提?。翰捎酶牧己蟮膲A裂法提取葉片DNA[18-20]，技術(shù)具體過程如下：

1) 取葉片放入2 mL離心管中，然后加入150 μL 0.4 mol·L-1的NaOH溶液，加入磁珠放于高速研磨機(jī)內(nèi)，65 Hz，研磨75 s。

2) 取出離心管，以4 000 r·min-1，離心5 min。吸取40 μL上清液放入新的離心管。

3) 最后加入200 μL Tris-HCl，混勻備用。

采用10 μL的PCR反應(yīng)體系，各成分具體含量如表1。

表2 前景選擇分子標(biāo)記引物序列

注：C 1、C 2、C 3是樣本量為18時(shí)的3次重復(fù)試驗(yàn)

表1 大白菜PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃(根據(jù)引物合成溫度調(diào)節(jié))退火30 s；72 ℃延伸30 s，一般30～35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

以8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，然后使用快速銀染法檢測(cè)電泳條帶多態(tài)性。膠片取出后置于燈箱上觀察、照相，對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)篩選出的具有多態(tài)性SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，在相同遷移位置上，帶型與輪回親本帶型相同者賦值為“0”，與供體親本帶型相同者賦值為“2”，為雙親共同的雜合帶型賦值為“1”，缺失標(biāo)記賦值為“—”。最后利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)際輪回親本基因組含量(%)=(SSR標(biāo)記位點(diǎn)純合數(shù)/SSR標(biāo)記總數(shù))×100%；

輪回親本基因組含量期望值=(1-1/2r+1)×100%，式中：r為回交次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前景標(biāo)記的篩選

課題組前期開發(fā)設(shè)計(jì)的抗源材料G 57中抗根腫病基因CRb連鎖的分子標(biāo)記Bra 0235-2和Bra 19317，經(jīng)驗(yàn)證在抗感雙親12 G 57和H 227間多態(tài)性表現(xiàn)好，可用于各世代的前景選擇。

圖1 兩標(biāo)記在雙親間的多態(tài)性驗(yàn)證

2.2 背景標(biāo)記的篩選

在分布于大白菜基因組的680個(gè)SSR標(biāo)記中[21-22]，選擇均勻分布于10條染色體的140個(gè)分子標(biāo)記，通過父母本間的篩選，獲得穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記20個(gè)，可用于各世代的背景選擇，序列信息見表2，上述引物均由華大基因公司合成。

2.3 不同供試群體數(shù)量對(duì)標(biāo)記Bra 019317篩選效率的影響

研究結(jié)果(圖2、表4)表明，在每一株系中標(biāo)記篩選的樣本量至少達(dá)到5株才可能篩選出含目標(biāo)性狀的抗病單株。但從背景回復(fù)率考慮，樣本量至少達(dá)到18株的回交群體中獲得輪回親本背景恢復(fù)率高的近等基因系的幾率更高。為在工作效率與中選率中尋找一個(gè)平衡點(diǎn)，建議后期篩選的株系樣本量設(shè)定為18株。

表3 背景選擇分子標(biāo)記引物序列

表4 不同數(shù)量的BC1F1群體篩選抗病帶型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 分子標(biāo)記背景選擇的最初世代對(duì)篩選效率的影響

試驗(yàn)從BC1F1世代起在分子標(biāo)記前景選擇的基礎(chǔ)上，利用20個(gè)背景選擇標(biāo)記對(duì)3個(gè)回交世代群體的入選單株進(jìn)行遺傳背景回復(fù)率統(tǒng)計(jì)(表5、表6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1代回交，54個(gè)樣本量的BC1F1群體的背景回復(fù)率范圍為16.7%～78.0%，RPG含量最高為78.0%，高于回交1代的期望值(75.0%)，但樣本間變異系數(shù)略大，變異系數(shù)為28.6%；回交2代后，BC2F1群體的背景回復(fù)率范圍為38.9%～94.4%，RPG含量最高為94.4%，高于回交2代的期望值(87.5%)，且變異系數(shù)為18.4%；回交3代后，BC3F1群體的背景回復(fù)率范圍為33.3%～85.2%，RPG含量最高為85.0%，低于回交3代的期望值(93.75%)，變異系數(shù)為16.5%。說明在各個(gè)回交世代中群體均存在極端個(gè)體，但在回交2代后群體間RPG差異相對(duì)更小，此時(shí)在背景選擇的分子標(biāo)記已獲得的情況下，盡早利用背景選擇篩選目標(biāo)單株，可以加快恢復(fù)輪回親本的基因組含量，節(jié)省人力、物力的投入，有效提高M(jìn)AS的效率。

3 討 論

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)(MAS)是目前提高傳統(tǒng)育種效率的常見手段，構(gòu)建高效準(zhǔn)確的MAS體系必須對(duì)篩選環(huán)節(jié)的各影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，例如分子標(biāo)記與基因間的連鎖程度，背景選擇的標(biāo)記數(shù)量等因素決定著MAS選擇的準(zhǔn)確性，群體的篩選數(shù)量，背景選擇開始的世代等因素影響著MAS選擇的效率。

分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性主要在于前景標(biāo)記與目標(biāo)基因間的連鎖度，一般連鎖越緊密，選擇的準(zhǔn)確率越高，需要篩選的樣本量數(shù)越少，此外目標(biāo)基因的連鎖標(biāo)記數(shù)量對(duì)篩選的準(zhǔn)確率也產(chǎn)生影響。潘海軍等[23]發(fā)現(xiàn)，針對(duì)豐富23群體，分別利用單標(biāo)記RpdH 5和RpdSll 84進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確率為91.0%和87.3%，但同時(shí)利用這2個(gè)標(biāo)記，篩選準(zhǔn)確率可提高到99%。此外，群體的篩選數(shù)量對(duì)MAS的選擇效率也起著重要作用。群體過大，篩選的工作量增加，往往造成人力物力的損耗。群體過小，目標(biāo)性狀中選率則必然降低，尤其是在一些低世代群體或低遺傳率的性狀存在的情況下更為明顯。因此本試驗(yàn)利用2個(gè)自主設(shè)計(jì)的連鎖標(biāo)記作為前景選擇，在保證目標(biāo)單株準(zhǔn)確性的前提下，采用前景選擇和背景相結(jié)合的方法，對(duì)不同大小的群體進(jìn)行目標(biāo)單株的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選群體數(shù)量達(dá)5株即可獲得目標(biāo)單株，但群體數(shù)量至少為18株時(shí)，才能獲得兼具目標(biāo)基因與高RPG的單株，這與張騰等[24]的研究結(jié)論基本一致。發(fā)現(xiàn)通過前景選擇隨機(jī)選擇7株即可獲得含目標(biāo)基因的單株，通過背景選擇從20株回交群體中更易獲得RPG含量高的單株。分析2個(gè)試驗(yàn)群體數(shù)量的細(xì)小差異可能是由于標(biāo)記的連鎖程度造成。

表5 同樣本量下不同回交世代背景篩選的目標(biāo)單株統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表6 各回交群體背景回復(fù)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

針對(duì)背景選擇執(zhí)行世代的影響，Hospital等[25]認(rèn)為，對(duì)單個(gè)或者連續(xù)多個(gè)回交世代進(jìn)行目標(biāo)單株篩選，背景選擇執(zhí)行的越晚，效率越高。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從回交2代起開展背景選擇相對(duì)獲得高RPG的目標(biāo)單株概率會(huì)更高，而且群體間RPG差異更小，可能是由于低世代群體內(nèi)重組個(gè)體多，變異方差大，所以目標(biāo)單株中選率大，而隨著世代的增加，MAS效率會(huì)逐漸降低。