宋立梅,肖志新,謝俊霞,徐華敏

(青島大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是中老年人神經退行性疾病中僅次于阿爾茲海默病的第二大神經系統(tǒng)疾病，其主要的臨床表現(xiàn)為運動障礙，主要的病理變化為黑質(SN)多巴胺能神經元受損，但其病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。眾多研究結果已證實，鐵代謝障礙參與了PD的發(fā)病[1-3]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是由1-甲基-4-苯基-4-丙氧基哌啶(MPPP)合成的副產物[4]。MPTP本身不具有毒性，但進入大腦后在單胺氧化酶B(MAO-B)的作用下轉化成具有毒性的甲基-苯基-吡啶離子(MPP+)，被多巴胺轉運體(DAT)特異性轉運到SN多巴胺能神經元內誘導PD的發(fā)生[5-8]。有研究表明，MPTP能夠誘導小鼠SN鐵的沉積[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腦內鐵運輸具有兩條途徑，其中一條途徑為腹側海馬(vHip)到內側前額葉皮質(mPFC)再到SN[10]。但是，此途徑異常是否是導致PD模型SN區(qū)鐵沉積的重要原因，目前尚未有報道。本研究采用MPTP誘導PD小鼠模型，檢測其SN區(qū)及mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物公司。飼養(yǎng)條件：溫度(21±2)℃，濕度(50±5)%，12-12 h循環(huán)晝夜光照，自由飲水進食。實驗前適應實驗室環(huán)境1周。

1.1.2實驗藥品 MPTP(Sigma-Aldrich)，用生理鹽水稀釋成6 g/L，注射量為30 mg/kg。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 將12只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組和MPTP組，每組6只小鼠。MPTP組小鼠連續(xù)5 d給予MPTP 30 mg/kg腹腔注射構建亞急性PD動物模型，對照組小鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2爬桿實驗 自制直徑1.2 cm、高50 cm的直木桿，桿頂部有一小木球，用紗布包裹防止小鼠打滑。實驗前1 d訓練小鼠，實驗時在安靜的實驗環(huán)境下將小鼠頭向上放于爬桿頂端，用秒表記錄小鼠開始運動至完全轉為頭向下的時間(轉頭時間)和小鼠爬下桿至四肢落地的時間(下桿時間)。每次檢測間隔1 min，共檢測5次，取平均值。

1.2.3Western Blot檢測SN和mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達變化 行為學檢測結束后，給予小鼠聯(lián)合麻藥(水合氯醛+烏拉坦)40 g/L腹腔注射麻醉，在冰上迅速解剖SN和mPFC區(qū)，將剖出組織按每4 mg加入100 μL裂解液充分研磨后冰上裂解30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，提取上清。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。按1∶4加入Loading buffer，金屬浴100 ℃煮5 min。蛋白經 SDS-PAGE 電泳(電壓80～120 V)后濕轉至 PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，再分別加入二價金屬離子轉運蛋白1(DMT1，1∶800)、轉鐵蛋白受體1(TfR1，1∶1 000)、鐵蛋白重鏈(H-Ferritin，1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，4 ℃搖床過夜。加HRP偶聯(lián)的二抗(用TBST稀釋至1∶10 000)，室溫孵育1 h。用UVP BioDoc-It成像系統(tǒng)(美國Upland)和ECL高靈敏化學發(fā)光液試劑盒(Milipore)顯影，采用Image J分析軟件進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 MPTP對小鼠運動功能的影響

爬桿實驗結果顯示，對照組和MPTP組小鼠轉頭時間分別為(1.925±0.182)和(3.242±0.513)s，下桿時間則分別為(6.001±0.396)和(9.872±1.045)s，MPTP組小鼠轉頭時間和下桿時間與對照組相比較均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.420、3.464，P<0.05)。

2.2 MPTP對小鼠SN區(qū)鐵代謝相關蛋白表達的影響

本文實驗結果表明，與對照組相比較，MPTP組小鼠SN區(qū)H-Ferritin、DMT1蛋白的表達明顯增加(t=3.969、3.333，P<0.01)，TfR1蛋白的表達明顯下降(t=2.318，P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠SN區(qū)鐵代謝相關蛋白表達的比較

2.3 MPTP對小鼠mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白表達的影響

兩組小鼠mPFC區(qū)DMT1、TfR1和H-Ferritin蛋白表達比較，差異均無顯著性(t=0.096～0.4279，P>0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白表達的比較

3 討 論

PD是中老年人常見的神經系統(tǒng)變性疾病，其臨床特征為靜止性震顫、肌強直、運動減少等運動障礙。目前PD的病因和發(fā)病機制尚不明確，可能與環(huán)境因素、遺傳因素、氧化應激以及炎癥反應等有關。有研究表明，SN區(qū)的鐵沉積參與了PD的發(fā)病[11-12]。在MPTP和6-羥基多巴胺(6-OHDA)構建的PD小鼠模型中均出現(xiàn)了明顯的鐵沉積及鐵代謝相關蛋白的表達異常[13-18]。

鐵代謝對于正常腦功能的發(fā)育至關重要。鐵攝取主要通過轉鐵蛋白(Tf)-轉鐵蛋白受體(TfR)途徑和非轉鐵蛋白結合鐵(NTBI)轉運途徑。Tf-TfR途徑被認為是大腦攝取鐵的主要途徑，而TfR1是該途徑的主要受體。NTBI途徑主要通過DMT1來攝取二價鐵離子。鐵的儲存主要由鐵蛋白來完成，鐵蛋白由H-Ferritin和輕鏈鐵蛋白(L-Ferritin)組成，H-Ferritin具有亞鐵氧化酶的活性，能將二價鐵離子轉為三價鐵離子；L-Ferritin存在成核位點，能促進鐵核的形成。在腦鐵代謝過程中任何環(huán)節(jié)異常均可能引起鐵代謝障礙，導致疾病的發(fā)生。有病例對照研究結果表明，Tf-TfR可能參與了PD的發(fā)病，其機制可能與多巴胺能神經元內的鐵代謝失調或線粒體功能障礙有關[19-21]。本實驗室研究證實，DMT1表達增加和鐵轉運蛋白(Fpn)表達下降可能是導致SN區(qū)鐵沉積的重要原因[14,22-23]。在PD病人和PD模型SN區(qū)均發(fā)現(xiàn)，鐵轉入蛋白DMT1的表達明顯升高[22-27]。有研究結果表明，PD動物模型SN區(qū)的鐵轉出蛋白Fpn表達下降[14,23,28-29]，但這一結果在PD病人中并未得到證實。

最新的研究證實了腦內存在兩條鐵轉運途徑：一條是從vHip到mPFC再到SN的鐵轉運途徑；另一條則是從丘腦(Tha)到杏仁核(AMG)再到mPFC的鐵轉運途徑[10]。并且證實vHip到mPFC再到SN的鐵轉運途徑異常是焦慮發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)[10]。PD病人的臨床表現(xiàn)中，除運動功能障礙外，還存在非運動癥狀的發(fā)生如焦慮、抑郁及記憶力障礙等[30]。mPFC區(qū)主要負責情緒調節(jié)，與焦慮、抑郁等有關，但是PD病人mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達是否發(fā)生改變尚未有文獻報道。本實驗選用MPTP誘導的亞急性PD小鼠模型，進行行為學和鐵代謝相關蛋白表達檢測。行為學實驗結果顯示，MPTP組小鼠轉頭時間和下桿時間與對照組相比均明顯延長，提示PD小鼠模型構建成功。Western Blot結果顯示，與對照組相比，MPTP組SN區(qū)鐵代謝相關蛋白H-Ferritin和DMT1表達水平明顯增加，TfR1蛋白表達水平明顯下降。提示DMT1的表達上調可能是SN鐵沉積的重要原因，而經典鐵轉運途徑Tf-TfR途徑可能并不參與SN鐵沉積。此外，SN區(qū)H-Ferritin表達上調，可能與SN鐵水平增加有關。但mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白DMT1、TfR1、H-Ferritin的表達與對照組相比均無明顯變化。表明MPTP誘導的PD小鼠模型鐵代謝蛋白的表達異常僅出現(xiàn)在SN，而mPFC區(qū)并無明顯的改變，提示mPFC區(qū)可能本身不具有儲存鐵的能力，與有關研究結果一致[10]。

綜上所述，MPTP能夠誘導小鼠運動障礙及SN區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達改變，但并不會引起mPFC區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達改變。腦鐵代謝的機制十分復雜且目前尚未完全闡明，仍需進一步實驗研究。