一種β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶熱檢測方法

柳世超，李彬春，李深偉，吳長新，謝斌，孟慶來*

（1.山西大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；3.上海國際旅行衛(wèi)生保健中心，上海，200335；4.隆德大學(xué) 純粹與應(yīng)用生物化學(xué)系，瑞典 隆德 SE-2100）

0 引言

酶熱傳感器是一種流動注射量熱生物傳感器，可以通過檢測酶催化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熱量對反應(yīng)體系中的酶或其底物進(jìn)行定量分析[1-2]。酶熱傳感器的檢測特異性強(qiáng)，對光、電、濁度不敏感；但對熱敏感性高，且檢測的多個熱信號可以疊加，相互間無干擾，因此檢測靈敏度可達(dá)到1×10-5℃的溫度變化。另外，酶熱傳感器完成樣品的檢測時間為5 min～10 min，檢測速度快，適用于快速定量分析檢測?；谶@些檢測優(yōu)勢，目前已經(jīng)發(fā)展出多種酶熱傳感分析儀廣泛應(yīng)用于酶活性測定[3]，全血代謝物臨床監(jiān)測[4]（葡萄糖和乳酸），廢水中農(nóng)藥及牛奶中外源添加的尿素和乳酸的檢測[5]。近年來，有研究者通過組裝有青霉素酶酶柱的酶熱傳感器（以下簡稱“青霉素酶酶熱傳感器”）發(fā)展了牛奶中非法外源添加的β-內(nèi)酰胺酶（解抗劑）和青霉素類抗生素血藥濃度進(jìn)行快速檢測的方法，并建立了病原菌抗生素耐藥性快速分析模型[6-8]。但由于該傳感器以青霉素酶為抗生素檢測酶，因此對頭孢霉素類及碳青霉烯類抗生素檢測活性差而限制了其廣泛應(yīng)用。

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1（New Delhi met allobeta-lactamase 1，NDM-1）是一種Ambler分類中的B 類 β-內(nèi)酰胺酶[9]，該酶對 β-內(nèi)酰胺類抗生素中的碳青霉烯類、頭孢霉素類及青霉素類抗生素都有強(qiáng)烈水解活性，其反應(yīng)活性依賴Zn2+，而且其酶活性可被EDTA等金屬離子螯合劑所抑制，但對β-內(nèi)酰胺類自殺性抑制劑及阿維巴坦等新型抑制劑不敏感[10-11]。本研究以原核表達(dá)、純化的NDM-1制備固相酶珠，組裝酶柱，應(yīng)用裝配有NDM-1酶柱的酶熱傳感器（以下簡稱NDM-1酶熱傳感器）建立了一種快速定量分析青霉素類、頭孢霉素類及碳青酶烯類抗生素的新方法并優(yōu)化了反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NDM-1基因及實驗所需引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，基因序列參考gene bank No.FN396876。 宿主菌大腸桿菌DH5α和BL21購買自TAKARA公司，表達(dá)載體pET-28購自Trans-Gen Biotech公司。通過引物去除NDM-1 N端信號肽同時引入 6個 His形成 his標(biāo)簽[12]。

DNA聚合酶2×Master Mix購買自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Quick cut NdeⅠ和Quick cut XhoⅠ購買自TAKARA公司；T4 DNA連接酶購買自Promega公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品物（100～5 000 bp）、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購買自生工生物工程（上海）股份有限公司；各種鹽類購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗所用各種生化試劑及抗生素購自北京索萊寶科技有限公司。Ni2+-NTA瓊脂糖珠購自Qiagen公司。直徑為125 μm ～ 140 μm且孔徑為50 nm的丙氨基衍生的可控孔玻璃珠（CPG）購買自德國Steinachglas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ET-2010-02型酶熱生物分析儀購自歐米克生物科技（武漢）有限公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計購自安捷倫公司；Nano-Drop one購自美國Thermo Fisher公司；HNY-200B搖床 購自天津歐諾儀器有限公司。

1.3 NDM-1酶的重組表達(dá)

利用質(zhì)粒小提試劑盒提取經(jīng)測序驗證基因核苷酸序列正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌。挑單克隆于5 mL 2×YT培養(yǎng)基中，硫酸卡那霉素終濃度50 mg/L，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。將種子液（體積分?jǐn)?shù)1%）接種于1 L 2×YT培養(yǎng)基中（卡那霉素終濃度50 mg/L），37℃，220 r/min培養(yǎng)到菌密度OD 600 nm 0.8～1時加入IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，然后16℃180 r/min過夜誘導(dǎo)表達(dá)。次日8 000 r/min、4℃離心收集菌體，用pH 8.0、50 mmol/L的PB緩沖液重懸，超聲破碎13 000 r/min、4℃離心收集上清。將收集到的上清加到平衡好的鎳柱中掛柱，然后用40 mmol/L咪唑柱洗滌雜蛋白，用200 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。將洗脫的NDM-1酶在4℃下用2 L pH 8.0、50 mmol/L的PB緩沖液透析兩次。對于純化的NDM-1酶，通過SDS-PAGE檢測分子量和純度，通過BCA試劑盒測定純化蛋白濃度。

1.4 穩(wěn)態(tài)動力學(xué)

以分光光度計（安捷倫）對NDM-1酶水解美羅培南的活性進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為以含有10 μmol/L ZnSO4，pH值為7.0的PBS緩沖液在 30℃條件下進(jìn)行檢測，以294 nm波長對酶水解反應(yīng)進(jìn)行掃描，每5 min檢測一次吸光值的變化來計算美羅培南的即時濃度。酶動力學(xué)常數(shù)（Km和kcat）通過計算NDM-1酶水解不同濃度美羅培南的初始反應(yīng)速度而獲取。濃度依賴的初始反應(yīng)速度通過Graphpad Prism 5.0軟件得到米氏方程。

1.5 NDM-1酶柱的制備

將450 μL CPG用戊二醛處理后在磷酸鹽緩沖液中室溫減壓活化30 min，在常壓下再活化30 min，用含 2 μmol/L ZnSO4的 1 × PBS清洗 CPG，加入NDM-1酶液500 μL，然后將CPG/酶液在室溫下翻轉(zhuǎn)孵育2 h，再4℃翻轉(zhuǎn)過夜孵育。用含1 μmol/L ZnSO4的1× PBS緩沖液清洗CPG，靜置去掉上清，加入等體積的0.4 mol/L乙醇胺室溫孵育2 h，用含1 μmol/L ZnSO4的1× PBS緩沖液再次清洗CPG，靜置去掉上清，裝入柱中完成NDM-1酶柱的制備。

1.6 Zn2+依賴性的測定

分別配置pH 7.0的PBS上樣緩沖液；含10 μmol/L ZnSO4、pH 7.0的 PBS上樣緩沖液；同時含10 μmol/L ZnSO4及 1 mmol/L EDTA、pH 7.0 的PBS上樣緩沖液。分別用這三種緩沖液配置終體積為 500 μL、濃度為500 mg/L的青霉素G（Penicillin G）、頭孢曲松（Ceftriaxone）、美羅培南（Meropenem）溶液。然后將抗生素上樣到NDM-1酶熱傳感器（上樣時上樣緩沖液與配置抗生素的緩沖液一致）并記錄反應(yīng)產(chǎn)生的熱信號數(shù)據(jù)。每個反應(yīng)3次重復(fù)。

1.7 最適pH的測定

分別配制 pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0 含有10 μmol/L ZnSO4的1 × PBS上樣緩沖液。分別用不同pH值的緩沖液配制終體積為500 μL、濃 度為 200 mg/L 的 青霉素 G（Penicillin G）、哌拉西林（Piperacillin）、頭孢曲松（Ceftriaxone）、頭孢唑啉（Cefazolin）、頭孢吡肟（Cefepime）、美羅培南（Meropenem）。然后在不同pH值的上樣緩沖液條件下測定抗生素通過NDM-1酶熱傳感器產(chǎn)生的熱信號（上樣時上樣緩沖液與配置抗生素的緩沖液一致），并記錄反應(yīng)數(shù)據(jù)。每個反應(yīng)3次重復(fù)。

1.8 對不同抗生素水解的測定

配制pH 7.0 、10 μmol/L ZnSO4的1× PBS上樣緩沖液。用這種緩沖液配置終體積為500 uL、濃度為 31.25 mg/L、62.5 mg/L、125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L的青霉素、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、美羅培南溶液。然后將不同抗生素按濃度從低到高的順序上樣NDM-1酶熱傳感器并記錄反應(yīng)產(chǎn)生的熱信號數(shù)據(jù)。每個反應(yīng)3次重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism5統(tǒng)計分析，P值＜0.05被認(rèn)為兩組間差異顯著。P＜ 0.05、P＜ 0.01、P＜ 0.001分別用*、**、***進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組NDM-1酶的表達(dá)、純化及活性

得到重組質(zhì)粒pET-28a-NDM-1并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，獲得重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌體超聲破碎低溫離心后取上清進(jìn)行親和層析純化、透析，SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示，重組NDM-1酶理論分子量大小為27.9 kDa，在25 kDa標(biāo)準(zhǔn)品條帶稍上的位置觀察到單一蛋白條帶，從分子量大小上證實了重組NDM-1酶的表達(dá)。純化的重組NDM-1酶純度＞95%，濃度為1.8 mg/mL。純化的蛋白在30℃及含有10 μmol/L ZnSO4的PBS緩沖液中對美羅培南的單位水解活性為108 IU/mg。在相同的反應(yīng)條件下純化的NDM-1對美羅培南水解的酶學(xué)常數(shù)，Km（μmol/L）、kcat（s-1）和kcat/Km（μ·（mol·L-1）-1·s-1）平均值分別為 47、86 和 0.55。這些結(jié)果表明純化的蛋白可高效水解碳青霉烯抗生素美羅培南，具有NDM-1酶典型酶學(xué)特征。

圖1 重組NDM-1酶SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant of NDM-1

2.2 固相后的NDM-1仍很好保持其特征性酶活力

酶通過共價鍵固相后可能會由于結(jié)構(gòu)的改變而影響其特征性酶學(xué)活性。NDM-1酶通過共價交聯(lián)而固相與CPG玻璃珠上。NDM-1酶是一種金屬離子依賴的碳青霉烯酶，其典型的酶學(xué)特征是對青霉素類、頭孢霉素類及碳青霉烯類抗生素都有很強(qiáng)的水解活性，而且水解活性依賴于Zn2+的存在，根據(jù)NDM-1酶的這些酶學(xué)特征，分析組裝有NDM-1酶柱的酶熱傳感器在反應(yīng)液中不存在Zn2+或同時存在Zn2+及其螯合劑EDTA的條件下對500 mg/L哌拉西林（青霉素類）、頭孢曲松（頭孢類）及美羅培南（碳青霉烯類）的反應(yīng)活性，發(fā)現(xiàn)在沒有Zn2+或Zn2+與EDTA共存的條件下，NDM-1酶熱傳感器對哌拉西林、頭孢曲松及美羅培南幾乎沒有檢測活性，而 10 μmol/L ZnSO4則會同時提高 NDM-1 酶熱傳感器對以上三種抗生素的檢測活性（圖2）。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)過共價固相并組裝于NDM-1酶熱傳感器的NDM-1仍然很好地保持了NDM-1酶特征性酶活性。構(gòu)建的NDM-1酶熱傳感器可以被用來進(jìn)行多種類β-內(nèi)酰胺抗生素的定量分析。

圖2 在鋅離子存在的條件下，NDM-1酶熱傳感器對哌拉西林、頭孢曲松和美羅培南都表現(xiàn)出高水平檢測活性Fig.2 NDM-1 sensor showed high hydrolytic activity to Penicillin G，Ceftriaxone and Meropenem in presence of Zn2+

2.3 應(yīng)用NDM-1酶熱傳感器可對β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析

本研究以青霉素類的青霉素G和哌拉西林；頭孢霉素類的頭孢唑啉（一代頭孢）、頭孢吡肟（四代頭孢）和頭孢曲松（三代頭孢）、碳青霉烯類的美羅培南為代表性的抗生素進(jìn)行檢測。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)在31.25到1000 mg/L的濃度范圍內(nèi)，NDM-1酶熱傳感分析儀檢測到的反應(yīng)信號隨加入的青霉素G、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢曲松、美羅培南的濃度增加而明顯增加，且都呈顯著線性相關(guān)（R2分 別 為 0.9972、0.9715、0.9598、0.9692、0.9596、0.9749）。這表明NDM-1酶熱傳感器可以在31.25 mg/L～1000 mg/L的濃度范圍內(nèi)對青霉素類、頭孢霉素類及碳青霉烯類三大類β-內(nèi)酰胺抗生素都進(jìn)行有效定量分析。

圖3 NDM-1酶熱傳感器對六種不同抗生素的水解反應(yīng)活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig3 Calibration curves of response activity of the NDM-1 sensor to hydrolyze six antibiotics

2.4 NDM-1酶熱傳感器對各種抗生素檢測的最優(yōu)pH值確定

為了探明NDM-1酶熱傳感器對各種抗生素檢測的最優(yōu)條件，進(jìn)一步分析在生理pH值附近范圍內(nèi)，NDM-1酶熱傳感器對200 mg/L濃度條件下各種抗生素的反應(yīng)活性。發(fā)現(xiàn)在pH 6.0～8.0的范圍內(nèi)，NDM-1酶熱傳感器對青霉素G、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟及頭孢唑啉的反應(yīng)活性在pH為6.5的條件下顯著高于 pH 6.0、7.0、7.5和 8.0（圖4AE）；對美羅培南的反應(yīng)活性在pH為8.0的條件下顯著高于 pH 6.0、6.5、7.0和 7.5（圖4）。這表明：NDM-1酶熱傳感器對青霉素G、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟及頭孢唑啉的最優(yōu)檢測pH值為6.5；對美羅培南的最優(yōu)檢測pH值為8.0。

圖4 NDM-1酶熱傳感器在不同pH條件下對青霉素G（A）、哌拉西林（B）、頭孢曲松（C）、頭孢吡肟（D）、頭孢唑啉（E）、美羅培南（F）的反應(yīng)活性Fig.4 Hydrolysis of Penicillin(A),Piperacillin(B),Ceftriaxone(C),Cefepime(D),Cefazolin(E),Meropenem(F)by the NDM-1 sensor under pH values from 6.0 to 8.0

3 討論

β-內(nèi)酰胺類抗生素主要由青霉素類、頭孢霉素類、碳青霉烯類及單環(huán)類（氨曲南）抗生素組成，由于其抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)而成為目前全球最廣為使用一類抗生素。對菌血癥等危重癥患者在抗生素治療后進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測對于提高治療有效率及安全性極為重要，而血藥濃度快速檢測技術(shù)則是保障血藥濃度監(jiān)測及時、有效的重要保證。目前國內(nèi)外對β-內(nèi)酰胺類抗生素的血藥濃度檢測目前還沒有商業(yè)化可利用的方法，基本均為實驗室自建方法[13]。高效液相色譜法串聯(lián)紫外檢測法或串聯(lián)質(zhì)譜檢測法是當(dāng)前檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素血藥濃度的常規(guī)方法，檢測準(zhǔn)確、靈敏性高[14-15]，但該方法預(yù)處理血漿樣品的時間可達(dá)幾個小時，從而無法滿足危重病人抗生素治療需要快速確定血藥濃度并據(jù)此及時調(diào)整抗生素治療劑量的需求。因此發(fā)展一種可以實現(xiàn)即時（30 min左右）甚至實時的β-內(nèi)酰胺類抗生素血藥濃度檢測方法目前仍是一個挑戰(zhàn)。

有研究表明通過建立的青霉素酶酶熱傳感器實現(xiàn)在30 min內(nèi)對人全血體外加標(biāo)青霉素進(jìn)行定量分析[6]，因此該技術(shù)近期被同行專家評議為有望實現(xiàn)即時（point of care test，POCT）β-內(nèi)酰胺類抗生素血藥濃度檢測的技術(shù)[13]。本課題組在近期研究中利用青霉素酶酶熱傳感器觀察到阿莫西林（一種青霉素類抗生素）在口服藥物者體內(nèi)血藥濃度的動態(tài)變化（未發(fā)表數(shù)據(jù)），然而由于青霉素酶本質(zhì)上對頭孢霉素類和碳青霉烯類抗生素水解作用差而使青霉素酶酶熱傳感器無法廣泛應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類抗生素血藥濃度檢測。雖有研究者應(yīng)用組裝有一種金屬β-內(nèi)酰胺酶酶柱的（酶具體種類未知）酶熱傳感器能在一定程度上提高對碳青霉烯類抗生素亞安培南的檢測活性，但該傳感器對亞胺培南的反應(yīng)活性與亞胺培南加入量之間仍缺少顯著的線性關(guān)系[8]，因此也無法適用于對碳青霉烯類抗生素血藥濃度的分析。

本研究根據(jù)NDM-1酶對頭孢霉素類和碳青霉烯類抗生素的強(qiáng)水解活性而組裝了帶有NDM-1酶酶柱的酶熱傳感器，該傳感器對青霉素類、頭孢霉素類和碳青霉烯類三類β-內(nèi)酰胺類抗生素都具有高水平的反應(yīng)活性，且嚴(yán)格依賴反應(yīng)緩沖液中的Zn2+（圖2）。這些表明固相后的NDM-1酶沒有由于共價交聯(lián)而改變其特征性酶學(xué)品質(zhì)，這極大地增強(qiáng)了應(yīng)用該傳感器對多種類β-內(nèi)酰胺抗生素進(jìn)行定量分析的可行性。尤為重要的是，與前期報道的一種金屬β-內(nèi)酰胺酶酶熱傳感器不同[8]，NDM-1酶熱傳感器由于對頭孢類抗生素和美羅培南的反應(yīng)活性隨著這些抗生素劑量增加而明顯線性增大（圖3），因此該傳感器可有效對頭孢霉素類、碳青霉烯類及青霉素類多種類β-內(nèi)酰胺抗生素進(jìn)行定量分析。多項來自ICU抗生素治療研究結(jié)果表明在抗生素靜脈輸液后2小時內(nèi)美羅培南、亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢曲松及哌拉西林這些抗生素的平均血漿血藥濃度在幾十mg/L的濃度范圍內(nèi)[16-20]。紫外分光光度法對不同類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測線性范圍有所差別，總體來講檢測的濃度都比較低，檢測范圍為零點幾到十幾mg/L，而且紫外分光光度法適合對比較純的樣品經(jīng)行檢測，不能用于對血漿等復(fù)雜體液的檢測[21]。中性羥胺法用于抗生素濃度測定時檢測范圍為幾百到幾千mg/L，也不能用于對血漿等復(fù)雜體液的檢測。而NDM-1酶熱傳感器有效檢測抗生素濃度范圍在31.25 mg/L～1 000 mg/L，因此從檢測靈敏性上來講應(yīng)用該分析儀對ICU危重癥患者進(jìn)行β-內(nèi)酰胺抗生素血藥濃度快速分析理論上可行。此外，本研究最后還確定了NDM-1酶熱傳感器對各被檢測抗生素的最大反應(yīng)活性pH值（圖4），為今后檢測不同種類抗生素血藥濃度探明了最佳pH值反應(yīng)條件。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用NDM-1酶熱傳感器建立了一種可以在較廣泛的范圍內(nèi)對青霉素類、頭孢霉素類及碳青霉烯類多種β-內(nèi)酰胺抗生素進(jìn)行定量分析的新方法。由于酶熱傳感技術(shù)有反應(yīng)特異性好，基本不受待測樣品的濁度和顏色背景的影響的特征。因此該檢測方法在β-內(nèi)酰胺類抗生素血藥濃度快速檢測，在線檢測抗生素發(fā)酵液內(nèi)抗生素濃度等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。