全新百部生物堿衍生物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活性研究

吳曉曉，張夢晨，楊鵬，武興康，馬開慶

（1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；3.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

0 引言

百部（stemona japonica）作為藥用植物在我國已有上千年的應(yīng)用歷史，作為其主要活性成分的百部生物堿（Stemonaalkaloids）是從直立百部（Stemo-na sessilifolia）和其近緣植物的根部分離得到的結(jié)構(gòu)類似，具有相同生源的一類結(jié)構(gòu)奇特且骨架變化多樣的生物堿[1]。迄今為止，已經(jīng)有150多種百部生物堿從植物中分離出來[2]。此類天然產(chǎn)物具有多樣性的結(jié)構(gòu)且具有顯著的生物學(xué)活性，包括鎮(zhèn)咳活性[3]，毒蕈堿 M5受體和 Sigma-受體結(jié)合活性[4]，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性[5]和 Pim-3激酶抑制活性[6]。在先前的研究中，我們通過使用路易斯酸催化串聯(lián)反應(yīng)和催化羰基化合成了百部生物堿天然產(chǎn)物bisdehydroneostemoninine，bisdehydrostemoninine和 parvistemonine A[7-8]，這有利于后續(xù)天然產(chǎn)物類似物的制備和進(jìn)一步的生物學(xué)評價(jià)。

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第四大最常被診斷出的癌癥，也是與癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因。近10年來我國結(jié)腸癌發(fā)病率呈明顯升高趨勢，據(jù)預(yù)測到2035年我國的結(jié)腸癌的發(fā)生率和死亡率都會有大幅度增加，嚴(yán)重威脅患者的健康和壽命[9]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是針對多種類型癌癥（包括CRC）的常用化療藥物，其主要通過抑制胸苷酸合酶（TS）并將其代謝物摻入RNA和DNA發(fā)揮其抗癌作用[10]，但5-FU的臨床療效隨著時間而顯著降低，這是由于癌細(xì)胞耐藥表型的發(fā)展所致。因此，進(jìn)一步研究預(yù)防耐藥性癌癥形成對于增強(qiáng)CRC治療的效力至關(guān)重要[11]，發(fā)現(xiàn)具有顯著抑制HCT-8及其耐藥細(xì)胞株活性的新型骨架小分子具有重要的意義。本文報(bào)道了百部生物堿及其衍生物的合成及其對HCT-8/5-FU和HCT-8細(xì)胞毒性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 合成實(shí)驗(yàn)

所有的實(shí)驗(yàn)均在氬氣保護(hù)下干燥溶劑中進(jìn)行。所有試劑均購自商業(yè)渠道，無需進(jìn)一步純化即可使用。使用TMS作為內(nèi)標(biāo)，在環(huán)境溫度下于Bruker AV-600光譜儀（Bruker Co.Billerica，美國）上記錄NMR光譜。使用Thermo Scientific Q Exactive（Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham，USA）在質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室記錄高分辨率質(zhì)譜（HRMS）。根據(jù)先前報(bào)道的方法制備天然產(chǎn)物bisdehydroneostemoninine（11）和衍生物 2、4-10[7]。衍生物 1根據(jù)先前報(bào)道的方法制備[8]。

1.2 生物測試

細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)腸正常細(xì)胞系FHC和人CRC細(xì)胞系DLD1和HCT116細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，Manassas，VA，USA）。 HCT-8和HCT-8/5-氟尿嘧啶抗性細(xì)胞系（HCT-8/5-FU）從中國典型培養(yǎng)物保藏所（中國上海）獲得。這些細(xì)胞在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長，并在裝有體積分?jǐn)?shù)5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中于37°C孵育。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成實(shí)驗(yàn)

（3aR，10bR）-1-亞甲基-1，3a，4，5，6，6，10b-六氫-2H-呋喃[3，2-c]吡咯并[1，2-a]氮雜化合物（3）在-78 ℃下向（3aR，10bR）-1，3a，4，5，6，6，10b-六氫-2H-呋喃[3，2-c]吡咯并[1，2-a]氮雜-2-2-酮（50 mg 0.26 mmol）的 THF（12.5 mL）溶液中緩慢加入在中的雙（三甲基甲硅烷基）酰胺鋰（1.53 mL，0.5 mol/L，1.0 mmol），然后將所得混合物在相同溫度下攪拌0.5 h。向上述溶液中加入Eschenmoser salt（396 mg，2.14 mmol），然后將所得混合物緩慢升溫至-30℃。通過在-30℃下添加飽和NH4Cl溶液淬滅反應(yīng)混合物，然后升至室溫。用EtOAc萃取反應(yīng)混合物3次，并在真空下除去溶劑，得到黃色油，其無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。

向上述粗胺化合物的異丙醇（1.25 mL）溶液中加入 2-氯 4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪（35.5 mg，0.2 mmol）和三乙胺（20 mg，27 μL），0.2 mmol）。將混合物在室溫?cái)嚢?.5 h并濃縮，得到殘余物，將其通過柱色譜法純化（PE：EA ＝ 1∶1），以55%的收率得到所需化合物29 mg。

2.2 生物測定

細(xì)胞活力測定：使用MTT測定法確定化合物3對指定細(xì)胞的抑制作用。將細(xì)胞以3×103/孔的密度分配在96孔板中，溫育過夜后在指定的時間段內(nèi)用不同濃度的化合物3處理細(xì)胞。將20 μL MTT（5 mg/mL）添加到培養(yǎng)基中，并在37°C下孵育4 h。除去上清液后，將DMSO添加到每個孔中。在570 nm處測量吸光度。

菌落形成測定：將HCT-8細(xì)胞和HCT-8/5-FU細(xì)胞以每孔500個細(xì)胞的密度接種到6孔板。將細(xì)胞用各種濃度的化合物3處理14 d，并保持在37°C。用甲醇固定并用結(jié)晶紫染色后，在相差顯微鏡下捕獲菌落。

FITC-Annexin V/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡：使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Key-GEN BioTECH，南京，中國）進(jìn)行FITC-Annexin V和PI細(xì)胞凋亡測定[12-14]。將HCT-8細(xì)胞用化合物3處理24 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌，重懸于結(jié)合緩沖液中，與 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI在室溫下于室溫孵育20 min。通過流式細(xì)胞儀（BD bioscience，美國）分析凋亡細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)值表示至少三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。兩組之間的差異是使用t-檢驗(yàn)確定的。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)

根據(jù)先前報(bào)道的方法制備了天然產(chǎn)物bisdehydroneostemoninine 和其衍生物 1-2，4-11[7-8]（如圖1所示）。化合物2在堿性條件下與Eschenmoser salt反應(yīng)，得到二甲胺中間體12，其無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。首先探索了采用DBU進(jìn)行甲基化和霍夫曼消除的常規(guī)方法，但該反應(yīng)僅得到了雙鍵異構(gòu)化化合物13而不是所需的產(chǎn)物3。注意到了一種簡便的一步法消除二甲基氨基，用2-氯-4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪和三乙胺在 Eschenmoser的亞甲基化反應(yīng)中進(jìn)行了研究，以55%的收率形成了化合物3。

圖1 Bisdehydroneostemoninine以及衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of bisdehydroneostemoninine（11）and its derivatives

圖2 化合物3的合成Fig.2 Synthesis of compound 3

3.2 生物活性

細(xì)胞化合物孵育24 h后，針對HCT-8/5-FU細(xì)胞篩選所有制備的化合物（如圖3所示），其中，天然產(chǎn)物bisdehydroneostemoninine對HCT-8/5-FU細(xì)胞沒有細(xì)胞毒活性。衍生物3在100 μmol/L的濃度下顯示出對HCT-8/5-FU細(xì)胞的有效細(xì)胞毒性作用。用乙基取代環(huán)外雙鍵，衍生物5顯示出弱的細(xì)胞毒性活性，而在羰基的α-位沒有取代基的衍生物2顯示沒有活性，這表明親電共價(jià)活性基團(tuán)部分是至關(guān)重要的活性部分。

圖3 bisdehydroneostemoninine和它的衍生物的細(xì)胞毒性活性（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.3 Cytotoxic activities of the bisdehydroneostemoninine and its derivatives（*P＜0.05，**P＜0.01）

為了檢查以上觀察到的現(xiàn)象是否不僅限于HCT-8/5-FU細(xì)胞，用化合物3處理HCT-8，DLD1，HCT116和HCT-8/5-FU，化合物3和上述CRC細(xì)胞孵育24 h后的結(jié)果表明，化合物3以劑量依賴性方式抑制所有CRC細(xì)胞增殖。當(dāng)CRC細(xì)胞系 于 100 μmol孵育24 h 時 ，HCT-8，HCT116 和HCT-8/5-FU的細(xì)胞存活率為40%～55%。值得注意的是，即使在100 μmol下，化合物3對正常結(jié)腸細(xì)胞FHC沒有顯著的抑制作用（圖4）。

圖4 化合物3劑量依賴抑制CRC細(xì)胞的生長（共孵育24 h）Fig.4 Compound 3 dose-dependently inhibited cell growth of CRC cells（incubation in 24 h）

進(jìn)一步的研究表明，化合物3以時間依賴性方式抑制HCT-8和HCT-8/5-FU細(xì)胞中的細(xì)胞增殖（圖5），HCT-8和HCT-8/5-FU細(xì)胞與化合物3孵育24 h后出現(xiàn)細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度為20 μmol化合物3與HCT-8孵育72 h后，細(xì)胞存活率減少到50%，當(dāng)濃度為50 μmol化合物3與HCT-8/5-FU孵育72 h后，細(xì)胞活力存活率減少到50%。

圖5 化合物3對CRC細(xì)胞增長的劑量和時間依賴抑制Fig.5 Compound 3 dose-and time-dependent inhibition of cell growth of CRC cells

為了進(jìn)一步確定化合物3對CRC細(xì)胞增殖能力的抑制作用，評價(jià)了化合物3在50 μmol和100 μmol濃度時，對HCT-8和HCT-8/5-FU集落形成能力的長期抑制作用。結(jié)果表明：化合物3可以顯著地抑制兩種CRC細(xì)胞系的集落生長（圖6）。此外，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明化合物3可以促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的細(xì)胞凋亡（圖7）。從以上結(jié)果可知，表明化合物3對能顯著抑制HCT-8和HCT-8/5-FU的增殖能力，并誘導(dǎo)其凋亡。

圖6 化合物3抑制細(xì)胞的集落形成Fig.6 Compound 3 inhibited colony formation of cells

圖7 化合物3誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞凋亡Fig.7 Compound 3 induced apoptosis in HCT-8 cells

4 結(jié)論

本文合成了bisdehydroneostemoninine和一系列百部生物堿衍生物，并評價(jià)了它們對HCT-8和HCT-8/5-FU細(xì)胞的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)具有百部生物堿骨架的小分子化合物3以劑量和時間依賴性方式誘導(dǎo)HCT-8和HCT-8/5-FU細(xì)胞凋亡；同時，該化合物還對其他不同遺傳背景的CRC細(xì)胞（DLD1，HCT116）具有顯著的抑制活性，但是其對正常結(jié)腸細(xì)胞（FHC）沒有作用，表明化合物3對CRC細(xì)胞的抑制具有一定的選擇性。上述研究結(jié)果表明化合物3對CRC細(xì)胞及其耐藥株具有顯著的抑制活性，且與現(xiàn)有臨床一線藥物5-FU的作用機(jī)制有區(qū)別，但是該類小分子是通過何種生物機(jī)制產(chǎn)生細(xì)胞毒性的需要進(jìn)一步的研究。