基于PI3K-AKT通路探討連翹歸尾煎抗乳腺癌作用機制研究

翟康欣，譚麗媛，遆安航，李思思，張淑蓉

（山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030600）

0 引言

2018年全球乳腺癌新發(fā)病約208萬例，死亡病例約62萬，以西醫(yī)為主的治療手段，毒副作用大，費用昂貴，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。中藥由于其多靶點，低毒性的優(yōu)點，越來越受到人們的關(guān)注[4-6]。越來越多的證據(jù)表明，中藥中富含的活性成分具有抗腫瘤作用，如：乳康飲能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路，促進PTEN、SHIP蛋白表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖[7]。陽和湯可激活MDA-MB-231細胞中Egr1/p21信號通路使細胞周期阻滯于G2/M 期，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[8]。

《景岳全書》中記載連翹（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）歸 尾 煎（Lianqiao Guiwei Decoction，LGD）由連翹、金銀花、歸尾、甘草、紅藤組成，具有清熱解毒，活血消腫的功效。文獻報道顯示，連翹歸尾煎臨床可用于急性乳腺炎、腮腺炎、牙周膿腫等疾病的治療[9]。然而，關(guān)于連翹歸尾煎抗腫瘤活性研究報道較少。課題組前期參考《景岳全書》中連翹歸尾煎的用法（好酒二碗，煎一碗服），選擇乙醇為提取溶劑，進行不同濃度乙醇提取物對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖抑制作用的研究，結(jié)果表明20%乙醇提取物效果最佳，并且研究顯示連翹歸尾煎提取物（LGD）具有顯著的抗乳腺癌作用[10]，但是其作用機制尚不清楚。因此本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對LGD抗乳腺癌的作用機制進行研究，為進一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定連翹為木犀科植物連翹的干燥果實，金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾，歸尾為傘形科植物Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch的干燥根及根莖，紅藤為木通科植物大血藤Sarge odoxa cuneata（Oliv.）Rehd.et Wils.的干燥藤莖，均購自同仁堂。L-15培養(yǎng)基購買自博士德生物工程有限公司；胎牛血清購買自賽澳美細胞技術(shù)有限公司；AKT和p-AKT抗體購買自bioworld生物技術(shù)有限公司；GAPDH購買自武漢三鷹有限公司；青鏈霉素購買自北京索萊寶科技有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠試劑購自普利萊公司；AKT的特異性抑制劑（SC79）購買自MCE公司。

1.2 LGD的提取

分別稱取連翹24 g、金銀花15 g、大血藤15 g、歸尾 9 g、甘草 3 g，按照料液比（1∶12）加入 20% 乙醇，回流3次，每次1 h。將提取物減壓濃縮至原先體積的一半后進行真空冷凍干燥，樣品于4℃保存。

1.3 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)條件為L-15完全培養(yǎng)基（10%（體積分數(shù)）胎牛血清及1%（體積分數(shù)）青霉素-鏈霉素），37℃、無CO2細胞培養(yǎng)箱。

1.4 CCK-8法檢測LGD對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

實驗設(shè)陰性對照組和給藥組，每組設(shè)5個復(fù)孔。取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，調(diào)整細胞數(shù)為4×104個/mL，觀察細胞完全貼壁后，加入不同濃度（0.1 mg/mL～ 1.0 mg/mL）的LGD孵育細胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔再加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，1 h后測定 450 nm處的吸光度值，根據(jù)測得吸光度值計算細胞增殖抑制率。

1.5 有效活性成分及靶基因的收集和篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm sp.php），檢索LGD所含藥味（連翹、金銀花、大血藤、甘草、當歸）的活性成分，篩選條件限定口服生物利用度（OB）≥ 30%且類藥性（DL）≥ 0.18。其次利用Pub-Chem 數(shù) 據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取已知活性成分的SMILE結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù) 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），獲取有效活性成分所對應(yīng)的靶基因。

1.6 乳腺癌相關(guān)靶基因的收集

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫平臺（https：//www.genecards.org/）檢索關(guān)鍵詞“Breast Cancer”，設(shè)置 Relevance score≥30，收集乳腺癌相關(guān)靶基因。

1.7 有效成分與疾病靶基因的Venn分析

將LGD的活性成分靶基因與乳腺癌靶基因?qū)?Bioinformatics&Evolutionary Genomics（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）平臺，獲取藥物與疾病的共同靶基因。

1.8 構(gòu)建“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將收集到的乳腺癌相關(guān)靶基因與篩選得到的藥物活性成分進行映射，建立活性成分與靶基因的對應(yīng)關(guān)系，得到治療乳腺癌的活性成分以及關(guān)鍵靶基因。通過Cytoscape軟件平臺進行數(shù)據(jù)可視化分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.9 構(gòu)建蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

借助 STRING（https：//string-db.org）平臺構(gòu)建蛋白間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)以及運用Cytoscape軟件可視化。輸入關(guān)鍵靶基因，限定種屬“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設(shè) 置0.4，獲得蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape，使用插件CentiScape計算度中心性（DC），篩選得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的核心基因。

1.10 核心靶基因GO（基因本體論）分析和KEGG富集分析

采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對LGD抗乳腺癌的關(guān)鍵靶基因進行GO分析與KEGG富集分析，結(jié)果以氣泡圖形式進行可視化分析。

1.11 Western blot法測定細胞Akt、p-Akt蛋白水平

將對數(shù)期的MDA-MB-231細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后，加入不同濃度（0.25、0.5、1.0 mg/mL）的LGD處理細胞24 h。用細胞刮收取細胞，于冰上裂解細胞（WBIP∶PMSF=100∶1）30 min后，13 000 r/min低溫離心后取上清，采用BCA法進行蛋白定量。隨后，SDS-PAGE分離蛋白并電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后于4℃過夜孵育一抗；二抗于室溫孵育。之后，用ECL發(fā)光液觀察蛋白條帶的變化。

1.12 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的結(jié)果，以平均值±標準差表示，組間差異分析采用t檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LGD抑制乳腺癌細胞的增殖

用不同濃度的LGD（0.1 mg/mL～1.0 mg/mL）處理MDA-MB-231細胞24 h后，結(jié)果顯示，LGD可顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖，并且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性，其IC50值為0.7872 mg/mL（圖1）。

圖1 LGD對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制率Fig.1 Cells inhibition rate of LGD on the proliferation of human breast cancer MDA-MB-231 cells

2.2 LGD有效活性成分及靶基因的收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到LGD相關(guān)有效活性成分共134個，其中連翹23個、金銀花23個、大血藤5個、甘草92個、當歸2個。收集LGD有效活性成分的預(yù)測靶基因，去重后最終獲得796個潛在作用靶基因（表1）。

表1 LGD的有效活性成分及靶基因數(shù)目Table 1 Number of effective components and genes in LGD

2.3 LGD抗乳腺癌相關(guān)靶基因

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共篩選出364個乳腺癌靶基因，將疾病相關(guān)靶基因和藥物作用靶基因取交集得到66個共同靶基因，確定為LGD抗乳腺癌的靶基因（圖2）。

圖2 LGD活性成分相關(guān)基因與乳腺癌相關(guān)基因Fig.2 Ingredient-related genes of LGD and breast cancer-related genes

2.4 “藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將連翹、金銀花、大血藤、甘草、當歸與對應(yīng)活性成分，活性成分與關(guān)鍵靶基因，關(guān)鍵靶基因與乳腺癌對應(yīng)關(guān)系以及屬性導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建完整的“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖3）。根據(jù)degree值進行排序，wogonin、DFV、Eriodyctiol（flavanone）、2-（4-hydroxyphenyl）ethyl（E）-3-（4-hydroxyphenyl）prop-2-enoate、Jaranol、Medicarpin、beta-sitosterol meso-1，4-Bis-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2，3-dimethylbutane可能為 LGD抗乳腺癌的主要物質(zhì)。

圖3 LGD抗乳腺癌的“藥物-成分-靶基因-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖粉色倒三角形為乳腺癌，綠色菱形為藥物，藍色三角形為活性成分，紅色圓形為關(guān)鍵靶基因，灰色連線代表各節(jié)點間相互關(guān)系Fig.3 Visual network diagram of"compound-gene-disease"of anti-breast cancer of LGDPink inverted triangle is breast cancer，green diamond is medicine，blue triangle is the active ingredient，red circle is key target genes，gray line represents the relationship between the nodes

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助STRING數(shù)據(jù)庫對LGD抗乳腺癌的關(guān)鍵靶基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），并通過Cytoscape可視化（圖4）。通過CentiScape計算DC均值為26.485，以大于26進行篩選，得到30個核心基因，以黃色圓點表示，其中蛋白激酶（AKT1）、雌激素受體 1（ESR1）、細胞周期蛋白 D1（CCND1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、表皮生長因子受體（EGFR）位于前五位，可能是LGD治療乳腺癌的關(guān)鍵靶點。

圖4 LGD抗乳腺癌靶基因相互作用圖圓點均代表靶基因，黃色圓點代表核心靶基因，灰色連線代表各節(jié)點間相互關(guān)系Fig.4 Diagram of proteins interactions network of anti-breast cancer of LGDDots represent genes，yellow dots represent core genes，gray lines represent the relationships between nodes

2.6 GO功能富集分析

利用David數(shù)據(jù)庫進行GO分析，共富集481個生物學(xué)過程及功能，涉及Bioprogress（BP，細胞生物過程）297個，包括蛋白質(zhì)自磷酸化、凋亡、藥物反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等；Cell Components（CC，細胞組成）47個，包括細胞核、細胞質(zhì)等；Molicular Function（MF，分子功能）74個，包括ATP結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。根據(jù)P值排序，選擇前20個進行氣泡圖展示（圖5）。

圖5 LGD抗乳腺癌靶基因的生物過程（GO）富集分析Y軸為生物學(xué)過程及功能名稱，X軸為富集因子，氣泡大小代表富集的基因數(shù)目，顏色代表富集顯著性（P值），顏色由綠到紅表示富集的程度由低到高，對應(yīng)的P值由小到大Fig.5 Enrichment analysis of Bioprocess（GO）of target genes of anti-breast cancer of LGDThe Y axis is the biological process and function name，the X axis is the enrichment factor，the size of bubble represents the number of enriched genes，the color represents the significance of enrichment（P value），the color from green to red indicates that the degree of enrichment varies from low to high，and the corresponding P value varies from small to large

2.7 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析共得到92條通路，根據(jù)P值進行排序，選擇前20個得到氣泡圖（圖6）。LGD抗乳腺癌的信號通路包括癌癥通路、腫瘤蛋白多糖、癌癥中的中央碳代謝、PI3K-AKT信號通路、黏著、ErbB信號通路、催乳素信號通路、VEGF信號通路、甲狀腺激素信號通路、Rap1信號通路、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、癌癥中的微RNA、Ras信號通路、Foxo信號通路等，還包括前列腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、膀胱癌等腫瘤的相關(guān)信號通路。

圖6 LGD抗乳腺癌靶基因KEGG信號通路富集分析Y軸為通路名稱，X軸為富集因子，氣泡大小代表富集的基因數(shù)目，顏色代表富集顯著性（P值），顏色由綠到紅表示富集的程度由低到高，對應(yīng)的P值由小到大Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of target genes of anti-breast cancer of LGDThe Y axis gives the pathway name，the X axis is the enrichment factor，the size of bubble represents the number of enriched genes，the color represents the significance of enrichment（P value），the color from green to red indicates that the degree of enrichment varies from low to high，and the corresponding P value varies from small to large

2.8 LGD對MDA-MB-231細胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

通過CCK-8實驗結(jié)果以及KEGG富集結(jié)果分析，LGD有可能通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路發(fā)揮抗乳腺癌的作用。為了進一步確定LGD能否通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路，發(fā)揮其抗乳腺癌的作用，采用不同濃度的LGD處理MDA-MB-231細胞24 h后，采用Western blot技術(shù)對細胞中AKT的表達水平進行檢測。如圖7A和圖7B所示，LGD能夠顯著抑制AKT的表達。隨后，用AKT的特異性激活劑 SC79（20 μmol/L）處理細胞后，細胞中 p-AKT的表達水平被顯著上調(diào)，當用0.5 mg/mL濃度的LGD繼續(xù)處理細胞24 h，上述現(xiàn)象被明顯地逆轉(zhuǎn)（圖7 C和D）。這說明LGD通過抑制AKT蛋白激活，從而調(diào)控PI3K-AKT信號通路。

圖7 采用western blot分析LGD通過抑制MDA-MB-231細胞A：AKT蛋白，B：AKT相對表達量，C：p-AKT蛋白，D：p-AKT相對表達量。Image J軟件分析柱狀圖中不相同的字母代表兩組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異，P＜0.05。相關(guān)蛋白表達水平發(fā)揮抗乳腺癌作用Fig.7 Anti-breast cancer effect of LGD through inhibiting the expression levels of related proteins MDA-MB-231 cells by western blot assayA：AKT protein，B：the expression levels of AKT，C：p-AKT protein，D：the expression levels of p-AKT，in Image J software columns with no letters in common are significantly different between two groups，P＜ 0.05

3 討論

中醫(yī)藥具有多成分、多靶點、高效低毒的優(yōu)點，可調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫調(diào)節(jié)等多個階段，目前對于中藥防治腫瘤的作用機制的研究尚處于初步階段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了藥理學(xué)和信息網(wǎng)絡(luò)，用于探索藥物對疾病的基本藥理作用及其機制，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可以直接從大量的數(shù)據(jù)中識別藥物和疾病靶點，適用于研究中藥與疾病之間復(fù)雜的作用機制[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LGD具有顯著的抗乳腺癌作用，但其作用機制尚不明確，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其抗乳腺癌作用機制進行分析。

本研究篩選出LGD的134個有效活性成分及其靶基因（表1），與檢索得到的乳腺癌相關(guān)靶基因進行映射，確定了66個關(guān)鍵靶基因（圖2），對“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析，確認wogonin、DFV、Eriodyctiol（flavanone）、beta-sitosterol等共 26個抗腫瘤活性成分（圖3）。有研究表明，核心成分wogonin可誘導(dǎo)MDA-MB-231永久性增殖抑制，降低TXNRD2的表達，控制細胞ROS水平[13]。LGD抗乳腺癌的PPI結(jié)果分析顯示AKT1、ESR1、CCND1、Caspase-3、EGFR 為核心靶點（圖4）。AKT1是腫瘤中最常見的活化蛋白激酶之一，在乳腺癌浸潤進展過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控AKT1的表達可抑制乳腺癌細胞增殖，以AKT1作為靶蛋白抑制乳腺癌的惡性進展可作為治療新方向[14-16]。ESR1突變是雌激素受體陽性類乳腺癌繼發(fā)性耐藥的重要機制之一，約有75%的乳腺癌診斷病例屬于該類；同時，ESR1也是乳腺癌預(yù)后不良的重要檢測指標[17-18]。CCND1（cyclin D1）的過度表達廣泛存在于原發(fā)性乳腺腫瘤中，作為靶向蛋白，其低表達可抑制細胞增殖、侵襲以及提高化療敏感性[19-20]。Caspase-3（CASP3）是一種半胱氨酸蛋白酶，主導(dǎo)細胞凋亡，有研究調(diào)查NAC手術(shù)的浸潤性乳腺癌患者，結(jié)果顯示Caspase-3可能為非pCR患者的潛在預(yù)后標志物[21]。EGFR是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素，有研究表明腫瘤組織中EGFR蛋白表達明顯高于癌旁正常組織，并與乳腺癌的侵襲能力、臨床分期等相關(guān)聯(lián)[22-23]。

通過對LGD抗乳腺癌的生物學(xué)過程進行富集分析，發(fā)現(xiàn)LGD可能是通過促進細胞增殖分化、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多靶點發(fā)揮治療乳腺癌的作用。KEGG富集分析結(jié)果顯示Pathways in cancer信號通路（癌癥信號通路）、PI3K-AKT信號通路等通路與LGD抗乳腺癌作用密切相關(guān)（圖6）。其中共25個靶基因參與了PI3K-AKT通路，提示LGD可能主要通過抑制PI3K-AKT信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。PI3K-Akt信號通路可調(diào)節(jié)細胞基本功能，如增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，其活性異?？蓪?dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)代研究表明PI3KAkt信號通路在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等[24]。興偉等發(fā)現(xiàn)山慈菇提取液可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路活化有關(guān)[25]。孫浩等研究發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可抑制MDAMB-231細胞的增殖，并使腫瘤細胞周期阻滯于G2/M期，可能與抑制PI3K/AKT信號通路的活化有關(guān)，可上調(diào) P53、P21蛋白表達，下調(diào) CyclinB1、CDK1蛋白表達[26]。通過 Western blot進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)LGD可抑制AKT的表達，而用AKT的特異性激活劑SC79處理后，p-AKT的表達水平被顯著上調(diào)，推測LGD通過影響PI3K-AKT信號通路發(fā)揮抗乳腺癌的效應(yīng)（圖7）。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選了LGD有效成分的靶基因，構(gòu)建了LGD的“藥物-成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，證明了LGD通過抑制PI3K-AKT信號通路發(fā)揮抗乳腺癌的作用機制，為后續(xù)實驗驗證提供理論依據(jù)。