硒化蒲公英多糖的制備、結(jié)構(gòu)表征及益生菌促增殖活性

王麗波，高婧宇，李騰飛，李蓮玉，劉 博，張洪龑，楊 昱，徐雅琴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

微量元素硒（Se）對(duì)生命活動(dòng)有重要的作用，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、保護(hù)視覺器官、延緩衰老、預(yù)防和治療心血管疾病等活性[1]。硒多糖是一類由硒和多糖結(jié)合而成的重要有機(jī)硒，相比無機(jī)硒，硒多糖的毒性更小，副作用更小[2]，且兼具多糖類生物活性，如抗氧化、降血脂、降血糖和抗炎活性等，能夠直接影響人體的生理功能。有研究報(bào)道，硒化修飾可改善多糖的生物活性：曾素娟等[3]對(duì)比了紅芪多糖和硒化紅芪多糖對(duì)口腔癌細(xì)胞SCC25增殖的抑制作用，結(jié)果表明各濃度多糖對(duì)SCC25細(xì)胞增殖的抑制作用均呈時(shí)間依賴性，且在相同條件下，硒化紅芪多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)；Liu Xuegui等[4]研究了苜蓿中多糖和硒化多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，硒化多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除能力強(qiáng)于原多糖，在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，硒化多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與VC相近，表明多糖經(jīng)硒化修飾后具有更好的抗氧化活性。

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.）是一種藥食同源植物，有“天然抗生素”的美譽(yù)，含有多糖、萜類、酚酸、黃酮、香豆素等成分[5]。在上述化合物中，多糖是重要的功能性物質(zhì)，已有研究表明蒲公英多糖具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗凝血等功效[6]。如Huang Dan等[7]研究了蒲公英多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最高，可達(dá)89.33%，半抑制質(zhì)量濃度為0.51 mg/mL，表明蒲公英多糖具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性；李雪石等[8]研究蒲公英多糖對(duì)鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠餐后血糖水平的影響，測定其血清胰島素水平、葡萄糖灌輸率、以及對(duì)α-糖苷酶體外活性的影響，結(jié)果表明蒲公英多糖具有降低餐后血糖的作用，且作用機(jī)制研究表明，蒲公英多糖可抑制小腸對(duì)麥芽糖的水解和對(duì)葡萄糖的吸收。目前，對(duì)蒲公英多糖的相關(guān)研究尚處于初級(jí)階段，鮮見有關(guān)蒲公英多糖硒化修飾的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以蒲公英根為原料，采用硝酸-亞硒酸鈉法制備硒化蒲公英多糖（selenized dandelion root polysaccharide，Se-DRP）。利用高效液相色譜、氣相色譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等多種方法表征多糖結(jié)構(gòu)，測定Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用以及對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用。旨在通過對(duì)Se-DRP結(jié)構(gòu)和活性的研究，探索蒲公英多糖的新應(yīng)用領(lǐng)域，為硒化多糖的深入研究及蒲公英資源開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根購自黑龍江省哈爾濱市藥材店，磨成粉后封袋密封保存，備用。

纖維素酶（≥50 U/g） 北京奧博興生物科技有限公司；硝酸、亞硒酸鈉、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、三氟乙酸、吡啶、醋酸酐、氯仿、冰醋酸（色譜純） 美國Sigma公司；植物乳桿菌10665、嗜酸乳桿菌 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大孔吸附樹脂D101、Sephadex G-100 南開大學(xué)化工廠；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-AFS6500型液相色譜原子熒光聯(lián)用儀 北京海光儀器有限公司；WFJ-7200型可見分光光度計(jì)、UV-2700雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；ALPHA-T型傅里葉變換紅外光譜儀、AVANCEIII 400兆NMR波譜儀 德國Bruker公司；2695/2414高效液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；GC-2010 plus氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蒲公英多糖的制備與純化

采用超聲輔助酶法，以去離子水為提取劑，料液比1∶30（m/V）、超聲功率700 W、超聲時(shí)間40 min、纖維素酶添加量0.8%（以蒲公英質(zhì)量計(jì)）的條件下提取多糖。提取液經(jīng)過濾、濃縮、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇醇沉、凍干后得到蒲公英粗多糖。

依次采用D101大孔吸附樹脂（3.5 cm×50 cm）和Sephadex G-100（1.8 cm×40 cm）純化蒲公英粗多糖。先后兩次洗脫條件分別為：1）D101大孔吸附樹脂：多糖上樣量為40 mg，去離子水為洗脫劑，洗脫流速2 mL/min；2）Sephadex G-100：多糖上樣質(zhì)量濃度1.0 mg/mL，去離子水為洗脫劑，洗脫流速0.6 mL/min。采用苯酚硫酸法[9]跟蹤檢測洗脫液，將多糖洗脫峰合并，濃縮、凍干后得到純化蒲公英多糖。

1.3.2 Se-DRP的制備

用50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的HNO3溶液溶解蒲公英多糖（500 mg），在室溫下攪拌30 min，加入0.5 g Na2SeO3和0.7 g BaCl2，將混合物在60 ℃下攪拌，反應(yīng)4 h。冷卻至室溫后，滴加1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7～8。加入0.5 g Na2SO4除去Ba2+，將反應(yīng)物3 500 r/min離心5 min，取上清液，用流水透析至加入抗壞血酸不顯紅色，再用去離子水透析12 h，濃縮、凍干即得到Se-DRP。

1.3.3 Se-DRP的理化性質(zhì)測定

1.3.3.1 成分測定

采用原子熒光光譜法測定硒含量[10]，苯酚硫酸法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9]，2,4-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[11]，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[12]，間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[13]。

1.3.3.2 分子質(zhì)量測定

配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（3 000、5 000、10 000、40 000、70 000 Da）和Se-DRP溶液，過0.22 μm的微孔濾膜后采用高效液相色譜儀測定分子質(zhì)量。

色譜條件：檢測器：2414示差折光檢測器；色譜柱：Ultrahydrogel Linear色譜柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱溫：（35±0.1）℃；流動(dòng)相：超純水；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.3 單糖組成測定

稱取20.0 mg Se-DRP于具塞試管中，加入4.0 mL 4 mol/L的三氟乙酸，密封振蕩5 min，在110 ℃條件下水解8 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入4 mL色譜級(jí)甲醇輔助氮吹，除盡三氟乙酸。按照參考文獻(xiàn)[14]，將單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解物用糖腈乙?；ㄑ苌幚砗?，利用氣相色譜儀分析單糖組成。

1.3.4 Se-DRP的結(jié)構(gòu)測定

1.3.4.1 紫外光譜分析

配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的Se-DRP溶液，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取2.0 mg Se-DRP樣品與KBr固體充分研磨后壓片，在4 000～400 cm－1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.3.4.3 NMR分析

將70.0 mg Se-DRP樣品溶于1 mL的D2O，充分振蕩核磁管使其完全溶解，室溫下采用400 MHz NMR儀測定1D-NMR（1H-NMR、13C-NMR）。

1.3.5 Se-DRP對(duì)益生菌增殖作用分析

1.3.5.1 培養(yǎng)基的配制

MRS肉湯培養(yǎng)基的配制：1 L去離子水中加入10.0 g蛋白胨、10.0 g牛肉膏、5.0 g酵母粉、1.0 mL吐溫-80、2.0 g K2HPO4、5.0 g乙酸鈉、2.0 g檸檬酸二銨、0.20 g MgSO4、0.05 g MnSO4，調(diào)節(jié)pH值至6.5（±0.05）。

MRS固體培養(yǎng)基的配制：將15.0 g瓊脂加入到MRS肉湯培養(yǎng)基中，制得MRS固體培養(yǎng)基。

增殖培養(yǎng)基的配制：在MRS肉湯培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 mg/mL）的Se-DRP，以不含碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對(duì)照，低聚果糖（fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS）為陽性對(duì)照。

1.3.5.2 菌種的活化

將MRS液體培養(yǎng)基用高壓滅菌鍋滅菌（120 ℃、15 min）。無菌環(huán)境下將植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，將兩個(gè)菌株分別接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h后，分別挑選兩個(gè)菌種的單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，同樣條件再培養(yǎng)36 h，得到活化菌種。

1.3.5.3 Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌增殖作用分析

將10 mL不含碳源的MRS液體培養(yǎng)基高壓滅菌。用無菌水溶解Se-DRP和FOS，過0.22 μm微孔濾膜后分別加入到MRS液體培養(yǎng)基中，使糖的終質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20 mg/mL。無菌環(huán)境下接種已活化的實(shí)驗(yàn)菌種，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液在600 nm波長處的光密度值（OD600nm）。

1.3.5.4 益生菌生長曲線的繪制

取干凈無菌的試管若干，各加入10 mL不含碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基，滅菌。將200 mg Se-DRP和FOS樣品用少量無菌水溶解后，過0.22 μm濾膜，無菌條件下分別加入到滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，使糖的終質(zhì)量濃度為20 mg/mL。無菌條件下分別接種活化的植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別在培養(yǎng)的0、4、8、16、24、32、40、48 h取樣，測定液體培養(yǎng)基pH值和600 nm波長處的光密度值（OD600nm），并繪制生長曲線。

1.3.6 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的測定

取1.0 mL多糖溶液（質(zhì)量濃度0.2～4.0 mg/mL）與1.0 mLα-淀粉酶溶液（質(zhì)量濃度0.6 mg/mL）和可溶性淀粉溶液（質(zhì)量濃度2.0 mg/mL）充分混合，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min，結(jié)束后，加入5.0 mL的二硝基水楊酸試劑沸水浴5 min，冷卻至室溫，采用紫外-可見分光光度計(jì)測定540 nm波長處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，按下式計(jì)算抑制率[15]。

式中：Ae為樣品、底物和酶的吸光度；Af為樣品和底物的吸光度；Ag為酶和底物的吸光度；Ai為底物的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3 次結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用Origin 8.5軟件繪圖，并用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著性分析方法為鄧肯檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-DRP的理化性質(zhì)

經(jīng)兩步柱層析分離后制得的純化蒲公英多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（94.24±0.48）%。Se-DRP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（93.47±0.75）%，可知硒化修飾后多糖純度基本沒有變化。成分測定結(jié)果表明，Se-DRP中的硒含量為（190.00±0.43）μg/g，糖醛酸含量為（103.80±0.05）mg/g，還原糖含量為（1.40±0.02）mg/g，不含蛋白質(zhì)。

Se-DRP的分子質(zhì)量采用高效液相色譜測定（圖1A），Se-DRP的洗脫曲線僅為一個(gè)尖銳對(duì)稱峰，表明其分子質(zhì)量分布范圍較窄，為均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖回歸方程lgm＝-0.624 4x+13.362（R2＝0.992 8），代入Se-DRP保留時(shí)間15.14 min，得到Se-DRP的分子質(zhì)量為8 102 Da。Se-DRP的單糖組成由氣相色譜測定（圖1B），相同條件下通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品單糖出峰時(shí)間可確定單糖種類。結(jié)果表明，Se-DRP由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，物質(zhì)的量比為0.64∶0.73∶19.36∶0.84∶1.00∶27.41。

圖1 Se-DRP液相色譜（A）和氣相色譜（B）圖Fig.1 Liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of Se-DRP

2.2 Se-DRP結(jié)構(gòu)

2.2.1 紫外光譜分析

由圖2A可知，Se-DRP在260 nm和280 nm波長處均沒有吸收峰，表明Se-DRP中不存在蛋白質(zhì)和核酸等成分。

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜是分析多糖結(jié)構(gòu)有利的工具，可根據(jù)多糖的特征吸收峰鑒定多糖的結(jié)構(gòu)。Se-DRP的傅里葉變換紅外光譜見圖2B，3 389.51、2 936.71 cm-1波長處對(duì)應(yīng)的吸收峰分別是由O—H、C—H的伸縮振動(dòng)引起的[16]，1 745.46 cm-1波長處的吸收峰是由C＝O的伸縮振動(dòng)引起的，1 608.33 cm-1波長處的吸收峰是由羧酸中C＝O伸縮振動(dòng)引起的[17-18]，1 424.08 cm-1波長處的吸收峰是C—H的彎曲振動(dòng)峰[19]，1 251.24 cm-1波長處的吸收峰是C—O糖苷鍵的振動(dòng)峰，1 106.98 cm-1和1 026.99 cm-1之間的吸收峰表明有吡喃糖存在，834.16 cm-1波長處的吸收峰表明多糖結(jié)構(gòu)中有α-糖苷鍵[20]，759.89 cm-1和638.48 cm-1處的峰歸因于Se＝O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)[19,21]。

圖2 Se-DRP的紫外光譜圖（A）和傅里葉變換紅外光譜圖（B）Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Se-DRP

2.2.3 NMR分析

多糖結(jié)構(gòu)中的糖殘基數(shù)目、糖環(huán)構(gòu)型、異頭構(gòu)型、連接位置等信息可通過NMR分析獲得。1H-NMR和13C-NMR譜圖中多糖的典型信號(hào)分別集中在δH3.0～5.5和δC60～110范圍內(nèi)，根據(jù)δH4.0～5.5異頭質(zhì)子和δC90～110異頭碳的共振信號(hào)，可判斷多糖的異頭構(gòu)型（α-、β-構(gòu)型）和糖環(huán)構(gòu)型（吡喃糖和呋喃糖）。一般來說，α-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子的δ大于5.0，而β-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子的δ小于5.0；呋喃糖的C2和C4在δ82～84間有信號(hào)，吡喃糖C3和C5的δ一般小于80[22]。

由圖3A可知，Se-DRP在異頭氫的共振區(qū)域范圍內(nèi)共有6 個(gè)信號(hào)峰，δ分別為4.40、4.56、4.90、5.03、5.18、5.37，確定為3 個(gè)α-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子和3 個(gè)β-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子[22]。同時(shí)在13C NMR譜圖（圖3B）中，在異頭碳的共振區(qū)域范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)有6 個(gè)信號(hào)峰，δ分別為99.54、100.41、103.23、103.68、107.43、109.25。結(jié)合譜圖及文獻(xiàn)[17,23-24]，將δ進(jìn)行歸屬，確定組成Se-DRP的主要糖殘基有→6)-β-D-葡萄糖-(1→（H1/C1～H6/C6位移值分別為4.40/103.23、3.43/69.90、3.63/74.29、4.01/70.57、3.95/76.98、3.67/67.94）、→3)-β-D-半乳糖-(1→（H1/C1～H6/C6化學(xué)位移分別為4.56/103.68、3.46/69.90、3.66/79.03、3.43/72.61、3.63/74.29、3.72/61.27）、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→（H1/C1～H5/C5化學(xué)位移分別為5.03/109.25、4.16/81.35、3.87/76.58、4.07/83.85、3.67/68.47）和→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→（H1/C1～H5/C5化學(xué)位移分別為5.37/99.54、3.63/71.41、3.85/73.70、3.74/79.03、4.17/70.57，C6為170.78）。根據(jù)文獻(xiàn)[25-26]，δ4.90/107.43和δ5.18/100.41分別歸屬于β-甘露糖和α-鼠李糖。

圖3 Se-DRP的1D NMR譜Fig.3 1D NMR spectra of Se-DRP

2.3 Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用

益生菌是腸道中一類對(duì)宿主有益，通過維持宿主腸道微生態(tài)平衡，從而對(duì)宿主產(chǎn)生確切健康功效的微生物總稱。雙歧桿菌和乳桿菌是兩類主要益生菌，約占腸道細(xì)菌總數(shù)的25%，包括長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌10665等[27-28]。研究表明，益生菌有預(yù)防和治療腸道疾病、刺激免疫功能、降低膽固醇和心血管病風(fēng)險(xiǎn)、抗腫瘤、抗癌及抑制病原菌的作用[29]。益生元是一種刺激細(xì)菌生長的化合物，它與機(jī)體的健康有關(guān)，能夠降低由微生物區(qū)系改變介導(dǎo)的疾病風(fēng)險(xiǎn)[30]。目前，F(xiàn)OS是公認(rèn)的最有利于益生菌增殖的碳源[31]，對(duì)乳桿菌等益生菌具有較好的增殖促進(jìn)作用。如王鑫[32]以FOS為陽性對(duì)照，研究了菜籽多糖及其修飾產(chǎn)物對(duì)嗜酸乳桿菌的益生作用，結(jié)果表明FOS及多糖均具有一定的增殖促進(jìn)作用，且FOS的作用更強(qiáng)。Huang Fei等[33]研究了發(fā)酵前后龍眼果肉多糖對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的益生活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后多糖弱于陽性對(duì)照FOS對(duì)菌種的促增殖活性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用FOS作陽性對(duì)照，研究Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的促生長作用。

2.3.1 Se-DRP對(duì)益生菌的促生長作用

培養(yǎng)液的光密度值（OD600nm）可以衡量菌體數(shù)量變化，OD600nm越大，表示菌液中所含有的菌體數(shù)目越多。由圖4A、B可知，在多糖質(zhì)量濃度5～20 mg/mL范圍內(nèi)，植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的數(shù)量都隨Se-DRP質(zhì)量濃度的增加而增加，表明Se-DRP對(duì)兩個(gè)菌種均有一定的增殖促進(jìn)作用，且菌種的增殖和Se-DRP質(zhì)量濃度之間呈劑量依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度到達(dá)15 mg/mL后，菌種數(shù)量增長趨勢相對(duì)變緩。此外，相同條件下，Se-DRP對(duì)兩個(gè)菌種的促生長作用均弱于FOS。

圖4 Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665（A）和嗜酸乳桿菌（B）的促增殖活性Fig.4 Effect of Se-DRP on promoting the proliferation of Lactobacillus plantarum 10665 (A) and Lactobacillus acidophilus (B)

2.3.2 益生菌的生長曲線

多糖作為碳源在被益生菌代謝利用的過程中，會(huì)被分解為一些單糖，而這些單糖可作為益生元提供能源物質(zhì)，促進(jìn)益生菌的生長。同時(shí)，益生菌利用多糖代謝會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，營造酸性環(huán)境，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體產(chǎn)生的酸不斷增加，培養(yǎng)液的pH值也下降。所以通過測定培養(yǎng)液中pH值的變化，可掌握菌體的增殖狀況[34]。

由圖5A、B可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，接種植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的Se-DRP和FOS液體培養(yǎng)基OD600nm均明顯上升，在培養(yǎng)36 h后，OD600nm基本維持穩(wěn)定，說明菌落總數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷增加，在培養(yǎng)36 h后，菌種的生長趨于穩(wěn)定。Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用可能與其低分子質(zhì)量關(guān)系較大。王霄[35]對(duì)比了菜籽多糖及其酶解產(chǎn)物對(duì)益生菌的增殖促進(jìn)作用，研究結(jié)果表明，酶解后分子質(zhì)量為7 184 Da的多糖對(duì)益生菌生長促進(jìn)作用強(qiáng)于酶解前分子質(zhì)量為52 485 Da的多糖，表明低分子質(zhì)量的多糖可被益生菌更好地利用[36]。

從培養(yǎng)液pH值與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系曲線可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌在Se-DRP培養(yǎng)基和FOS培養(yǎng)基中的pH值均呈下降趨勢，在培養(yǎng)36 h后，pH值趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)橐嫔L過程中分泌的糖苷酶能夠?qū)⒍嗵撬獬蓡误w，然后通過代謝將單體降解成短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸和乳酸）和氣體，從而導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值明顯降低。但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，培養(yǎng)基中的碳源基本被消耗，所以益生菌的生長變緩，發(fā)酵液的pH值也趨于穩(wěn)定[37]。

綜上，Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌具有良好的增殖促進(jìn)作用，可視為潛在的益生元。

圖5 植物乳桿菌10665（A）和嗜酸乳桿菌（B）的生長曲線Fig.5 Growth and acid production curves of Lactobacillus plantarum 10665 (A)and Lactobacillus acidophilus (B) in the presence and absence of Se-DRP

2.4 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用

α-淀粉酶抑制劑通過抑制小腸中糖類水解酶的活性，減少淀粉類食物中葡萄糖的釋放，延緩碳水化合物的吸收。因此，天然的α-淀粉酶抑制劑可作為口服降糖藥。如圖6所示，在質(zhì)量濃度0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，Se-DRP和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率均隨質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，Se-DRP和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率分別為（48.34±0.96）%和（77.47±1.07）%。隨后二者對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率保持平穩(wěn)。在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，Se-DRP的抑制率為（52.34±1.45）%，低于阿卡波糖的抑制率（（79.94±1.24）%）。這是由于多糖在低質(zhì)量濃度時(shí)，酶過量，每個(gè)多糖分子都可以和酶分子結(jié)合，抑制酶的活性，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，所有的酶分子都已和多糖結(jié)合，再增加多糖的質(zhì)量濃度，抑制率不再明顯升高[38]。

萬艷娟等[39]報(bào)道了質(zhì)量濃度2.00 mg/mL的南瓜多糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為2.50%。王文武等[38]研究了海藻多糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用，結(jié)果顯示，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其活性抑制率也不斷提高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10.00 mg/mL時(shí)，其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率不再增加，半抑制質(zhì)量濃度為2.85 mg/mL?？梢奡e-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用強(qiáng)于南瓜多糖和海藻多糖，可應(yīng)用于碳水化合物消化調(diào)節(jié)、食品升糖指數(shù)控制。

圖6 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of Se-DRP on α-amylase activity

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)制備了硒含量為（190.00±0.43）μg/g的Se-DRP，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（93.47±0.75）%，由6 種單糖組成，分子質(zhì)量8 102 Da。Se-DRP具有多糖特征吸收峰，主要糖殘基為→6)-β-D-葡萄糖-(1→、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→、→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→和→3)-β-D-半乳糖-(1→。在Se-DRP質(zhì)量濃度為5～20 mg/mL范圍內(nèi)，隨多糖Se-DRP質(zhì)量濃度的增加，對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的生長促進(jìn)作用顯著增強(qiáng)，同時(shí)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，說明Se-DRP可被益生菌利用，是潛在的低分子質(zhì)量多糖類益生元。在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率和質(zhì)量濃度之間呈劑量依賴性，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，Se-DRP的抑制率可達(dá)（48.34±0.96）%，表明Se-DRP可作為天然的α-淀粉酶抑制劑應(yīng)用于降血糖藥物或功能性食品。