萊菔子炮制前后HPLC特征圖譜 及4種成分含量變化研究

高思佳，王計(jì)瑞，秦偉瀚，王云紅，程磊，陽勇，張小梅

重慶市中藥研究院，重慶 400065

萊菔子為十字花科植物蘿卜Raphanus sativusL.的干燥成熟種子[1]，多以炒制品入藥，含硫代葡萄糖苷（glucosinolates，以下簡稱“硫苷”）。硫苷是存在于十字花科植物特有的次生代謝產(chǎn)物，多與植物細(xì)胞質(zhì)中的硫代葡萄糖苷酶（芥子酶）共存[2]。研究表明，炒制不僅可抑制萊菔子中黑芥子酶的活性，阻止硫苷類成分蘿卜硫苷的分解，且能引起其他化學(xué)成分的較大變化[3]。目前萊菔子炮制研究集中于炮制前后化學(xué)成分變化規(guī)律[4-7]、指紋圖譜[8-9]等，而缺少對炮制溫度至芥子酶徹底破壞后化學(xué)成分變化的相關(guān)研究。

本研究基于“生熟異治”“生升熟降”炮制理論，通過預(yù)試驗(yàn)確定萊菔子最佳炮制工藝，采用HPLC建立萊菔子生品和炒制品的特征圖譜，同時(shí)測定萊菔子炮制前后特征成分蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的含量，采用系統(tǒng)聚類分析（HCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對生品和炒制品特征圖譜共有峰進(jìn)行分析，探討萊菔子炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律，為萊菔子生品和炮制品的質(zhì)量控制及其炮制機(jī)理研究提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996檢測器，Waters Empower化學(xué)工作站），美國沃特世科技有限公司；AEG-45SM十萬分之一天平，日本島津公司；BP121S萬分之一天平，德國Sartorius公司；CY-25中藥炒藥機(jī)，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；KQ-400 DE型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。

對照品芥子堿硫氰酸鹽（批號PS011003，純度≥98.0%）、蘿卜硫苷（批號PS011849，純度≥95.0%），成都普思生物科技股份有限公司；對照品萊菔素（批號BP1814，純度≥98.0%）、芥子酸（批號BP1778，純度≥98.0%），成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。12批不同產(chǎn)地萊菔子樣品購于重慶上藥慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司、廣東源森泰藥業(yè)有限公司、康美藥業(yè)股份有限公司、安徽亳州藥材市場等，經(jīng)重慶市中藥研究院生藥研究所瞿顯友研究員鑒定為十字花科植物蘿卜Raphanus sativusL.的干燥成熟種子，樣品來源見表1。乙腈、甲醇為色譜純，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；其他試劑均為分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠；水為超純水。

表1 萊菔子樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 炒制品制備

取萊菔子樣品S1～S12各500 g，置炒藥機(jī)中，130 ℃炒10 min，即得萊菔子炒制品，依次編號為C1～C12。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液

取蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素、芥子酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含蘿卜硫苷256.0 μg、芥子堿硫氰酸鹽52.1 μg、萊菔素193.0 μg、芥子酸35.7 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液

取萊菔子炒制品粉末（過2號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，精密稱定，超聲處理（功率250 W，頻率40 Hz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，以水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得[10]。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5%→8%A；15～25 min，8%→20%A；25～40 min，20%→24%A；40～50 min，24%→45%A；50～52 min，45%→5%A；52～55 min，5%→5%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：225 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 特征圖譜建立與評價(jià)

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S12、C12），按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖。以5號峰（芥子堿硫氰酸鹽）為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于2%，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，相似度均大于0.995，表明檢測系統(tǒng)的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品（S12、C12）粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以5號峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰相對保留時(shí)間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于2%，相似度均大于0.990，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S12、C12），按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以5號峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD均小于2%，相似度均大于0.995，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 特征圖譜建立

取不同批次萊菔子生品（S1～S12）和炒制品（C1～C12）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版），分別以萊菔子生品S1和炒制品C1的圖譜為參照圖譜，選擇多點(diǎn)校正進(jìn)行匹配，分別生成萊菔子生品和炒制品的特征圖譜（見圖1）。生品特征圖譜匹配出8個共有峰，炒制品特征圖譜匹配出11個共有峰。通過與對照品比對，結(jié)合DAD紫外光譜，共標(biāo)定4個色譜峰，分別為1號（蘿卜硫苷）、5號（芥子堿硫氰酸鹽）、10號（萊菔素）和11號（芥子酸），見圖2。

圖1 萊菔子HPLC特征圖譜

圖2 萊菔子生品和炒制品中4種成分HPLC圖

2.4.5 相似度評價(jià)

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對萊菔子生品和炒制品特征圖譜分別進(jìn)行相似度分析，生品和炒制品特征圖譜相似度范圍分別為0.959～0.980、0.966～0.996，表明各批次萊菔子樣品間所含化學(xué)成分基本一致。

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1 系統(tǒng)聚類分析

將萊菔子生品和炒制品特征圖譜共13個特征峰峰面積（生品或炒制品中未有峰的峰面積記為0）導(dǎo)入SPSS20.0軟件，采用組間均聯(lián)法，以歐氏距離平方為測度進(jìn)行HCA，結(jié)果見圖3。24批特征圖譜被聚為2類，生品（S1～S12）為第Ⅰ類，炒制品（C1～C12）為第Ⅱ類，表明所選特征峰可有效區(qū)分萊菔子生品和炒制品，也表明萊菔子化學(xué)成分在炮制前后有較大變化，差異明顯。

圖3 萊菔子特征圖譜聚類分析

2.5.2 正交偏最小二乘法判別分析

將萊菔子生品和炒制品特征圖譜共13個特征峰峰面積作為變量導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，建立OPLS-DA模型。提取2個主成分，模型質(zhì)量參數(shù)R2X＝0.985，預(yù)測能力參數(shù)Q2＝0.964，均大于0.5，R2與Q2差距＜0.2，表明模型的擬合能力和預(yù)測能力良好。設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列50次做置換檢驗(yàn)（見圖4），R2和Q2擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.204（Y＜0.3）和-0.785（Y＜0.05），表明所建立的模型可靠，無過度擬合現(xiàn)象，能夠判別分析組間差異。經(jīng)OPLS-DA模型分析分別生成得分圖（見圖5）和載荷圖（見圖6）。由得分圖可知，數(shù)據(jù)點(diǎn)均分布在95%置信區(qū)間內(nèi)，炮制前后數(shù)據(jù)點(diǎn)區(qū)分明顯，表明萊菔子炮制后化學(xué)成分含量發(fā)生了較大改變。載荷圖顯示13個特征峰，在X軸上距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)權(quán)重值越大，特征峰1（蘿卜硫苷）、9、10（萊菔素）離聚類中心較遠(yuǎn)，表明這3個峰所代表的化合物含量在炮制前后變化最為顯著。變量重要性投影（VIP）結(jié)果顯示，特征峰1、9、10的VIP值分別為2.6、1.7、1.3，均大于1（見圖7），進(jìn)一步表明這些化合物是萊菔子炮制前后的主要差異標(biāo)志性成分。

圖4 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)

圖5 萊菔子生品和炒制品特征圖譜OPLS-DA得分散點(diǎn)圖

圖6 萊菔子特征圖譜共有峰OPLS-DA載荷散點(diǎn)圖

圖7 萊菔子特征圖譜共有峰VIP圖

2.6 含量測定

2.6.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素、芥子酸與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按4個成分峰計(jì)算均不低于5000。

2.6.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、5、10、20、30 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸含量（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的RSD分別為0.97%、0.78%、0.81%、0.97%，表明儀器精密度較好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一對照品和供試品溶液（生品S12測定芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸，炒制品C12測定蘿卜硫苷），按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果對照品中蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的RSD分別為0.86%、0.89%、0.46%、0.79%，供試品中蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的RSD分別為1.04%、0.78%、0.91%、1.27%，表明對照品溶液、供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一萊菔子生品和炒制品（生品S12測定芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸，炒制品C12測定蘿卜硫苷），按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸RSD分別為1.01%、1.26%、1.08%、1.32%，表明本法重復(fù)性較好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的萊菔子粉末6份（生品S12測定芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸，炒制品C12測定蘿卜硫苷），每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入與樣品中含量相當(dāng)?shù)奶}卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分的平均回收率。結(jié)果蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的平均回收率分別為100.14%、99.61%、99.05%、99.52%，RSD%分別為1.94%、2.34%、1.86%、2.17%，表明本法回收率良好。

2.6.7 樣品含量測定

取萊菔子生品（S1～S12）和炒制品（C1～C12），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸含量，結(jié)果見表3。12批萊菔子生品中蘿卜硫苷未檢出，芥子堿硫氰酸鹽含量為0.21%～0.36%，萊菔素含量為0.80%～1.61%，芥子酸含量為0.02%～0.05%；炒制品中蘿卜硫苷含量為2.70%～4.52%，芥子堿硫氰酸鹽含量為0.29%～0.52%，萊菔素和芥子酸均未檢出。

表3 萊菔子生品和炒制品中4種成分含量測定結(jié)果（%，n＝2）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，萊菔子于130 ℃炒制10 min，炒制品中蘿卜硫苷和芥子堿含量最高，“殺酶保苷”效果最好；炒制品形體鼓起，種皮易捻脫，富含油性，具濃郁特殊香氣，外觀性狀辨識度較高。因此，本試驗(yàn)選擇130 ℃炒制10 min作為萊菔子炮制工藝。

全波長掃描結(jié)果表明，萊菔子水提液在波長225 nm處色譜峰較多，蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸的吸收較強(qiáng)，故選擇225 nm作為檢測波長。本試驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸溶液、乙腈- 0.1%磷酸溶液作為流動相及不同洗脫程序?qū)ιV峰峰形和分離效果的影響，最終確定以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫。蘿卜硫苷是判斷萊菔子炒制是否達(dá)到炮制要求的標(biāo)志性成分，且在水中溶解性較好[11]，因此選擇水作為提取溶劑。

本試驗(yàn)比較了不同提取方式（超聲、回流）、提取時(shí)間（30、45、60 min）和提取次數(shù)（1、2、3次）對萊菔子生品和炒制品中蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素和芥子酸提取效果的影響，結(jié)果表明超聲提取30 min、提取1次為供試品溶液最佳提取條件。

萊菔子特征圖譜顯示，生品和炒制品具有各自的共有特征峰，可有效評價(jià)萊菔子生品和炒制品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。生品和炒制品特征圖譜中均匹配出峰2、5（芥子堿硫氰酸鹽）、6、7、12、13，峰10（萊菔素）、11（芥子酸）為生品特有峰，峰1（蘿卜硫苷）、3、4、8、9為炒制品特有峰，表明炮制前后萊菔子化學(xué)成分變化較大。HCA和OPLS-DA結(jié)果表明，匹配出的共有峰可作為萊菔子生品和炒制品的特征峰，所生成的特征圖譜可用于判別萊菔子生品與炒制品，且OPLS-DA表明峰1（蘿卜硫苷）、9、10（萊菔素）是萊菔子炮制前后主要差異標(biāo)志性成分。

本試驗(yàn)采用同一色譜條件建立了萊菔子生品及炒制品的特征圖譜，結(jié)合HCA和OPLS-DA有效區(qū)分生品和炒制品，得出炮制前后差異成分；同時(shí)測定了萊菔子生品中芥子堿硫氰酸鹽、萊菔素、芥子酸和炒制品中蘿卜硫苷、芥子堿硫氰酸鹽含量。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確，具有定性和定量雙重作用，可為有效區(qū)分萊菔子生品和炒制品并控制其質(zhì)量提供依據(jù)。