市售筍子燒牛肉中優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

甯雨蕎，田 靚，袁先鈴，劉永明

（四川輕化工大學生物工程學院，四川自貢643000）

0 引言

中國傳統菜肴歷史悠久，講究“色、香、味、形、質、營、器”七大特點[1]，具有豐富的文化內涵，同時在人們的日常生活中扮演著重要角色。在長期的實踐和經驗積累過程中，傳統菜肴的營養(yǎng)性、安全性、健康性都得到了檢驗與驗證[2]。但是，傳統菜肴工藝原始、工業(yè)化程度低、標準化程度不高。目前，已經實現工業(yè)化的主要有紅燒肉、大盤雞、梅菜扣肉、麻婆豆腐、魚香肉絲、鹽水鴨、冷吃兔、紅燒獅子頭、酸菜魚、黃燜雞、干鍋肥腸、湯類等，大部分菜肴還未實現工業(yè)化。傳統菜肴的工業(yè)化是我國食品工業(yè)化的必由之路，勢必成為我國食品工業(yè)經濟新的增長點。

食品在加工、運輸、貯藏、銷售等環(huán)節(jié)中，很容易受微生物所污染[3]，微生物污染是食品腐敗變質最根本的原因。在中國傳統菜肴工業(yè)化過程中，關鍵的問題之一是如何防腐保鮮，延長產品的貨架期。在這方面，國內已開展了很多相關的研究，如李慧等人[4]研究了土豆燒牛肉方便菜肴脹袋微生物，發(fā)現主要的優(yōu)勢腐敗菌是幾種芽孢桿菌和表皮葡萄球菌。彭先杰等人[5-6]對導致香辣仔鵝、冷吃兔腐敗的微生物進行分離與鑒定，發(fā)現導致這些產品腐敗的是各種葡萄球菌和芽孢桿菌。劉彩云等人[7]對市售鹵牛肉腐敗的微生物進行了分離與鑒定，發(fā)現導致其腐敗的優(yōu)勢菌為魏斯氏菌和佐氏庫特氏菌。鄧靈等人[8]對導致即食小龍蝦腐敗的微生物進行了檢測，發(fā)現蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌是導致其腐敗的主要微生物。胡秀虹等人[9]對導致凱里腌韭菜根的優(yōu)勢腐敗菌生長特性進行了研究，發(fā)現導致其腐敗的主要是芽孢桿菌。李德紅等人[10]發(fā)現副黃假單胞菌、特基拉芽孢桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和香坊腸桿菌導致了醬鹵鴨食管冷藏期間的腐敗。圖爾蓀阿依·圖爾貢等人[11]研究了香辣蟹中特征性腐敗菌和香料的抑制作用。于曉慧等人[12]分離鑒定了常溫保藏即食小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌為檸檬酸桿菌。賈鳳娟等人[13]毛木耳紅油即食食品的殺菌防腐保鮮技術。Niu C等人[14]研究了香辣醬中致氣性腐壞菌。這些研究都為促進傳統菜肴工業(yè)化奠定了基礎。

針對特定食品特定腐敗菌防腐技術的開發(fā)，其前提是特定腐敗菌的識別。目前，雖然有近些年發(fā)展起來的基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜法（Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的微生物分離與鑒定方法[15-17]，但是傳統的微生物分離、生化鑒定和16S rRNA序列鑒定方法[18-23]依然是經典的微生物鑒定方法。以傳統菜肴筍子燒牛肉為研究對象，對導致腐敗的優(yōu)勢腐敗菌采用反復劃線培養(yǎng)分離純種，然后通過生化鑒定和分子生物學鑒定結合的方法對這些腐敗菌進行鑒定，為傳統菜肴筍子燒牛肉的特異性防腐技術的開發(fā)及其工業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

筍子燒牛肉制作工藝：牛肉切塊→洗凈→燎煮→加料炒制→燜煮→裝袋→滅菌。

牛肉、水發(fā)竹筍、生姜、大蔥、食鹽、雞精、白砂糖、香桂、花椒，購自宜賓市臨港蓉戎連鎖超市。

氫氧化鈉（分析純）、30%過氧化氫、氯化鈉（分析純），成都金山化學試劑有限公司提供；番紅花紅T、液體石蠟、碘化鉀、乳糖、蔗糖，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠提供；磷酸二氫鈉（分析純），天津市津東天正精細化學試劑廠提供；無水磷酸氫二鉀（分析純），廣東光華科技股份有限公司提供；二水氯化鈣（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司提供；結晶紫（分析純）、碘（分析純）、95%乙醇、可溶性淀粉（分析純）、硫酸銨（分析純）、七水硫酸鎂（分析純）、甘露醇（分析純）、無水葡萄糖（分析純）、明膠（分析純）、D果糖（分析純），成都市科隆化學品有限公司提供；牛肉膏、胰蛋白胨、西蒙氏枸櫞酸鹽、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司提供。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IFD型潔凈工作臺，蘇州市萬隆化學試劑有限公司產品；SK210型生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司產品；FCD215SEA型海爾冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司產品；LRH250C型生化培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集與預處理

（1）樣品的采集。筍子燒牛肉選自四川省宜賓市翠屏區(qū)，分裝于滅菌一次性餐盒中，帶回實驗室存放于常溫待其腐敗。

（2）樣品的預處理。將腐敗的筍子燒牛肉置于滅菌的研缽中，研碎后稱量5 g溶于45 mL無菌生理鹽水中，然后梯度稀釋成10-1～10-7的菌懸液備用。

1.3.2 菌株分離與腐敗特性試驗

（1）微生物的分離。用移液器吸取100μL稀釋后的菌懸液加到牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，用均布器涂布均勻，于37℃下培養(yǎng)24 h；每個梯度做2個平板并做空白對照組；挑選每個梯度培養(yǎng)基中的典型單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，直至得到純菌落。

（2）優(yōu)勢腐敗菌的篩選。將分離得到的菌株加入自制的滅菌筍子燒牛肉中，確定菌株的致腐能力。通過檢測接種了純種菌株的菜肴中氨基酸態(tài)氮的質量分數，將致腐能力較強的株菌視為優(yōu)勢腐敗菌。

（3）氨基酸態(tài)氮的質量分數的測定。參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[24]。

1.3.3 優(yōu)勢腐敗菌的生理生化鑒定

參考《常見細菌系統鑒定手冊》[25]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[26]，對優(yōu)勢腐敗菌分別進行革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗、培養(yǎng)基穿刺試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、碳源利用試驗、VP測定試驗、檸檬酸鹽試驗、MR試驗和產葡聚糖試驗。

1.3.4 優(yōu)勢腐敗菌的分子生物學鑒定

在37℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)分離得到的純種菌株過夜，取1.5 mL純種菌株懸浮液裝入的離心管中，送至上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司檢驗測序，從菌懸液中提取基因組DNA時采用的方法為硅基質吸附柱法。提取的DNA被選作模板用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR 50μL擴增體系為2×Taq Master Mix 25μL，上游引物與下游引物各1μL，模板DNA 1μL并用ddH2O加到50μL；95℃預變性5 min，循環(huán)1次；95℃變性15 sec，50℃退火20 sec循環(huán)40次；72℃下延伸40 sec。PCR擴增完成后進行凝膠電泳，隨之進行測序鑒定。

1.4 數據處理

將DNA測序獲得16S rDNA序列與NCBI數據庫中的序列進行BLAST比對分析，之后選取近似菌種序列采用MAGE 5軟件構建系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 腐敗菌株的分離篩選

2.1.1 腐敗菌株的菌落特征

經過稀釋梯度涂布平板和多次平板劃線培養(yǎng)，得到4株純種菌株，分別命名為1，2，3，4號菌。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)見表1。

2.1.2 腐敗菌腐敗特性

熟肉制品腐敗時蛋白質經水解或酶解可由大分子變成小的蛋白質成分，如水解后的產物經胨、肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構成蛋白質最基本的物質，由此可將氨基酸態(tài)氮作為肉類腐敗程度檢驗指標之一。

表1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

4種菌株使筍子燒牛肉腐敗后樣品中氨基酸態(tài)氮質量分數見圖1。

圖1 4種菌株使筍子燒牛肉腐敗后樣品中氨基酸態(tài)氮質量分數

由圖1可知，1號菌的氨基酸態(tài)氮質量分數為0.027%，2號菌的氨基酸態(tài)氮質量分數為0.064%，3號菌的氨基酸態(tài)質量分數為0.085%，4號菌的氨基酸態(tài)氮質量分數為0.072%。1號菌的氨基酸態(tài)氮質量分數最小，而其他3種菌株的含量相差不大。說明2，3，4號菌的致腐能力較1號強。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌的生理生化鑒定結果

采用革蘭氏染色法，革蘭氏染色是鑒別細菌的一種方法，根據細菌細胞壁上主要成分的差異，將染色后的細菌分成兩大類，即革蘭氏陽性菌（紫色）與革蘭氏陰性菌（紅色）[27]。在分離純化試驗中，于腐敗的筍子燒牛肉中分離純化出4株菌，將這4個菌株進行革蘭氏染色，用100油鏡觀察。

菌體革蘭氏染色結果見圖2。

圖2 菌體革蘭氏染色結果

由圖2可知，4種菌均為革蘭氏陽性菌。1號菌為球菌，個體較小。2，3，4號菌均呈桿狀，其中2號菌為短桿菌，單節(jié)，兩端圓滑；3號菌為長桿菌，單節(jié)或兩個相連接，菌體較細；4號菌為長桿菌，菌體彎曲。

通過過氧化氫酶試驗、培養(yǎng)基穿刺試驗、明膠水解試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽試驗、碳源利用試驗、MR試驗、VP試驗、產葡聚糖試驗，對得到的已分離純化的菌株進行生化鑒定。

菌株生化鑒定結果見表2。

表2 菌株生化鑒定結果

依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[25]與《常見細菌系統鑒定手冊》[26]對上述試驗結果進行對比，初步對純化得到的菌株進行鑒定。2，3，4號菌均為過氧化氫試驗陽性、明膠水解試驗陽性、淀粉水解試驗陽性、MR與VP試驗陽性，在碳源利用上均可利用葡萄糖、果糖、甘露醇和蔗糖，初步判斷2，3，4號菌為芽孢桿菌屬細菌；1號菌過氧化氫試驗陽性、培養(yǎng)基穿刺試驗陽性、明膠水解試驗陽性、MR與VP試驗陽性，在碳源利用上只能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，初步判斷為葡萄球菌屬細菌。

2.3 優(yōu)勢腐敗菌的分子學鑒定結果

提取4號菌的總DNA，用相應的引物擴增其16S rDNA序列。

純種菌株16S rDNA凝膠電泳圖見圖3。

由圖3可知，4個樣品的條帶都在1 000～2 000 bp。

將4株菌的16S rRNA與NCBI數據庫中的進行比對，并在此基礎上構建系統發(fā)育樹。

1號菌16S rRNA系統發(fā)育樹見圖4，2號菌16S rRNA系統發(fā)育樹見圖5，3號菌16S rRNA系統發(fā)育樹見圖6，4號菌16S rRNA系統發(fā)育樹見圖7。

圖3 純種菌株16S rDNA凝膠電泳圖

圖4 1號菌16S rRNA系統發(fā)育樹

圖5 2號菌16S rRNA系統發(fā)育樹

圖6 3號菌16S rRNA系統發(fā)育樹

圖7 4號菌16S rRNA系統發(fā)育樹

由圖4可知，1號菌與金黃色葡萄球菌菌株ATCC 12600（Staphylococcus aureus strain ATCC 12600）同源性最高，其與金黃色葡萄球菌菌株ATCC 12600（Staphylococcus aureus strain ATCC 12600）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度為94，故判斷其為金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性細菌[28]，廣泛存在于空氣、塵土和動物的排泄物中[29]，因此很容易污染食物。腐敗的筍子燒牛肉中分離得到了金黃色葡萄球菌，說明樣品在加工、運輸等過程中被該菌所污染，而且在適宜條件下成為致腐敗的優(yōu)勢菌。

由圖5可知，2號菌的序列與暹羅芽孢桿菌KCTC 13613菌株PD-A10（Bacillus siamensis KCTC 13613 strain PD-A10）同源性最高，可判斷2號菌為暹羅芽孢桿菌；由圖6可知，3號菌的測序結果顯示其與蘇云金芽孢桿菌菌株IAM 12077（Baillus thuringiensis strain IAM 12077）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度達到98，所以判斷3號菌為蘇云金芽孢桿菌；由圖7可知，4號菌的測序結果顯示其與枯草芽孢桿菌菌株168（Bacillus subtilis subsp.subtilis strain 168）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度達到90，所以判斷4號菌為枯草芽孢桿菌。由此可見，在保證筍子燒牛肉不被致病菌污染的情況，導致筍子燒牛肉腐敗的細菌主要是革蘭氏陽性的芽孢桿菌。筍子燒牛肉在制作過程中，主要是燜煮等高溫處理，一般不耐高溫的微生物都能夠被殺死，而具有芽孢的細菌則不能夠在這種條件下殺死。因此，導致筍子燒牛肉腐敗的優(yōu)勢菌大多為芽孢桿菌，這跟其他傳統菜肴中分離鑒定出的優(yōu)勢腐敗菌相一致[4-11]。

3 結論

筍子燒牛肉是一種燒菜類傳統菜肴，深受廣大消費者喜愛。早在2010年，何江紅等人[30]就研究了筍子燒牛肉的標準化控制，然而其工業(yè)化還未完全實現，在生產實際中產品很容易腐敗。研究主要分離出了筍子燒牛肉中的腐敗菌，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、部分生化鑒定對分離出的菌株作了初步的鑒定，然后對純化菌株進行16S rDNA進行測序，并將其序列與NCBI數據庫中的序列進行比對，構建了系統進化樹，最終確定了導致筍子燒牛肉腐敗的菌株的種屬。筍子燒牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌主要為金黃色葡萄球菌、暹羅芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。其中，枯草芽孢桿菌對筍子燒牛肉的致腐能力最強。枯草芽孢桿菌是常見食品腐敗菌，在肉制品中生長快速，會引起筍子燒牛肉的快速腐敗變質，使營養(yǎng)物質大量損失。在筍子燒牛肉想要達到工業(yè)化生產，可以在不影響食品風味的條件下，從包裝條件及配方改造等方面抑制優(yōu)勢腐敗菌的生長，從而達到延長產品保質期的目的。