姜東鳳，唐啟偉，肖艷飛，任曉麗，皇甫和平*，石冬梅*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州450011；2.鄭州新里程企業(yè)管理咨詢有限公司，河南 鄭州450011)

依據(jù)乳房組織和乳汁的病理變化可對(duì)奶牛臨床型乳房炎做出診斷，但因引起該病的病原種類(lèi)非常多，故通過(guò)檢測(cè)、明確該病的病原種類(lèi)，了解其藥物敏感性，對(duì)該病的治療具有重要意義。

檢測(cè)牛乳房炎病原菌的經(jīng)典方法有細(xì)菌分離鑒定，核酸檢測(cè)等。PCR技術(shù)因其具有快速、靈敏等特點(diǎn)，在病原微生物的早期診斷中被廣泛運(yùn)用[1-2]。同時(shí)，隨著全基因組測(cè)序項(xiàng)目的大量開(kāi)展，幾乎所有常見(jiàn)病原微生物的序列信息都已被公布，所以利用PCR擴(kuò)增、序列比對(duì)來(lái)確定分離菌株種類(lèi)已經(jīng)成為鑒定病原微生物的一個(gè)準(zhǔn)確方法[3]。而在同一反應(yīng)體系里添加多種目的基因引物，達(dá)到同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)基因片段的多重定量PCR，也成為篩選引起某一疾病的主要病原微生物的主要手段[4]。本研究采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、PCR擴(kuò)增測(cè)序、測(cè)序比對(duì)、藥敏試驗(yàn)，又采用16聯(lián)牛乳房炎病原菌核酸PCR-熒光探針?lè)▽?duì)太原市某奶牛場(chǎng)奶牛臨床型乳房炎進(jìn)行了研究，篩選該場(chǎng)乳房炎的主要致病菌，并為治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 乳樣采自太原市某患有乳房炎的奶牛場(chǎng)，根據(jù)乳房組織和乳汁的病理變化共采集4頭來(lái)自不同乳房的9份乳樣，采集乳樣時(shí)先消毒乳頭，棄去前段乳汁，無(wú)菌取樣10 mL，做好標(biāo)記，4 ℃存放備用。

1.1.2 分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù) Primer 5.0用于引物設(shè)計(jì)、Seqman用于DNA序列和測(cè)序峰圖分析、 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于基因信息查詢和比對(duì)。

1.1.3 試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鮮血瓊脂平板購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、引物由上海生工公司合成、DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，測(cè)序由武漢擎科生物技術(shù)有限公司完成、16聯(lián)牛乳房炎病原菌核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳意瑞生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 病原菌分離時(shí)，先用滅菌槍頭吸取少量奶樣，均勻涂布于血瓊脂平板，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，18～24 h后，觀察菌落形態(tài)，選擇單菌落，并進(jìn)行革蘭氏染色鑒定及后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 病原菌的革蘭氏染色及顯微鏡檢查 用接種環(huán)挑取少量培養(yǎng)菌落涂于載玻片上自然干燥固定，進(jìn)行革蘭氏染色，具體步驟為：在干燥固定的抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液染色2 min，然后用水沖洗干凈；滴加革蘭氏碘液進(jìn)行媒染2 min，用水沖洗干凈；滴加 95%乙醇進(jìn)行脫色約20 s，水洗干凈；滴加稀釋的碳酸復(fù)紅復(fù)染約20 s，水洗干凈； 染色完畢自然干燥，顯微鏡下觀察。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 挑選可疑單菌落放入液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h, 菌液用于PCR擴(kuò)增及測(cè)序。DNA提取參照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取好的DNA -20 ℃存放備用。

參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA引物：16S-F：5'-CCGAATTCGTCG ACAACAGAGTITGATCATGGCTCAG-3'；16S-R：5'-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTT ACCTTGGTACGACTT-3'。預(yù)期擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度1 500 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ExTaq 0.125 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 17.375 μL，DNA模板 1 μL。PCR反應(yīng)程序： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s， 62 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min， 12 ℃ 2 min。

1.2.4 測(cè)序比對(duì) 采用雙向測(cè)通，拼接序列，然后用NCBI 16s Ribosomal RNA sequences(Bacteria and Archaea)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 藥物敏感性檢測(cè) (紙片擴(kuò)散法) 先將分離純化的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜；接著用生理鹽水將菌液稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管一致；接種于瓊脂平板上，并在每個(gè)平板上放置5個(gè)藥敏紙片； 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，然后測(cè)定細(xì)菌抑菌環(huán)的直徑。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，判定病原菌對(duì)藥物的敏感性[6]。

1.2.6 16聯(lián)牛乳房炎病原菌qPCR檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明，對(duì)牛乳房炎常見(jiàn)的16種接觸傳染型病原菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)和鑒定。從試劑盒中取出所有的Q-PCRMasterMix試劑、酶制劑、dH2O等，置于冰上融化；試劑在使用前先混合均勻，2 000 r/min離心20 s備用；分別吸取Q-PCRMasterMix 1～4至1.5 mL滅菌離心管，體積為21.5 μL/管，每管加入1 μL EnzymeMix，混勻后短暫離心；向裝有PCR反應(yīng)液1～4的PCR管中分別加入2.5 μL 的9個(gè)待檢樣本的DNA，震蕩離心。根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，4種PCR反應(yīng)液在PCR過(guò)程中設(shè)置的報(bào)告熒光為FAM、HEX、ROX、Cy5，淬滅基團(tuán)為None。PCR反應(yīng)體系設(shè)置為:50 ℃去污染 3 min； 95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60℃退火40 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線，讀出結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

通過(guò)對(duì)9份奶牛乳房炎乳樣進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，除了1個(gè)樣品沒(méi)有菌落以外，8個(gè)乳樣均可觀察到相應(yīng)菌落，且革蘭氏陽(yáng)性菌占87.5%，革蘭氏陰性菌占12.5%。詳見(jiàn)表1。

表1 革蘭氏染色結(jié)果

2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

如表2所示，除了一個(gè)菌液因?yàn)镻CR回收純度不夠，無(wú)法檢測(cè)外，對(duì)其他菌液16S rRNA基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)，結(jié)果顯示，樣品1、2、4、7、8分離出的革蘭氏陽(yáng)性菌為棒狀桿菌，與NCBI公布的序列號(hào)MH119724.1的Corynebacteriumphoceense的序列相似度達(dá)到99%以上，而從樣品5、6、9中分離出的病原菌序列分別與已公布的氣球菌屬(MG593598.1)、鏈球菌屬(LR641947.1)和嗜冷桿菌屬(EU845428.1)序列相似度達(dá)到99.93%，99.72%和98.89%。

表2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從表3可知，對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，8個(gè)乳樣中的純化菌種均對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、利福平、多西環(huán)素和頭孢噻呋等6種抗生素高度敏感，9號(hào)乳樣革蘭氏陰性菌嗜冷桿菌屬對(duì)氨曲南、磺胺異惡唑敏感。

2.4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

表4所示，對(duì)16種牛乳房炎常見(jiàn)的接觸傳染型病原菌的監(jiān)測(cè)和鑒定發(fā)現(xiàn)：9個(gè)乳樣中有8個(gè)乳樣檢測(cè)到了的細(xì)菌，其中6個(gè)樣品中檢測(cè)到弱陽(yáng)性菌屬，5個(gè)為克雷伯氏菌屬，1個(gè)為金黃色葡萄球菌。另外有6個(gè)樣品中檢測(cè)到疑似葡萄球菌， 3個(gè)樣品中檢測(cè)到疑似β-內(nèi)酰胺酶抗性基因，同時(shí)，還各檢測(cè)到1例疑似原壁菌屬、無(wú)乳鏈球菌、粘質(zhì)沙雷菌、大腸桿菌和腸球菌屬。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 Corynebacterium phoceense可能是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一

棒狀桿菌種類(lèi)較多，可在機(jī)體皮膚、上呼吸道和泌尿生殖道粘膜等處定居，大多為非致病菌或條件性致病菌。Cresci等[7]2016年首次從腎移植的病人藥液中分離出Corynebacteriumphoceense，并證實(shí)了該菌屬于棒狀桿菌屬，比粘金色棒狀桿菌小，比乳酸桿菌、潰瘍棒狀桿菌、乳腺炎棒狀桿菌等大，該菌對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、強(qiáng)力霉素等幾乎所有的抗生素敏感，但對(duì)呋喃妥因和硝唑有一定的耐藥性。

在該菌的功能研究中，泰國(guó)學(xué)者Intanoo等[8]首次在奶牛的瘤胃液中分離出了該菌，并發(fā)現(xiàn)其可以降解奶牛飼料中的黃曲霉毒素。而本試驗(yàn)首次在該奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎中分離出該菌，占鑒定比例的62.5%，也證實(shí)了該菌對(duì)利福平、環(huán)丙沙星、慶大霉素等6種抗生素高度敏感。該菌的成功分離，且在乳房炎奶牛乳樣細(xì)菌中占一定的比例，證明了該菌可能是引起該奶牛場(chǎng)乳房炎的主要病原菌之一。

3.2 奶牛乳房炎臨床治療需要合理用藥

本研究通過(guò)TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR 對(duì)牛乳房炎常見(jiàn)的接觸傳染型病原菌包括金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌、支原體屬等和環(huán)境型病原菌包括葡萄球菌屬、大腸桿菌、克雷伯氏菌屬、原壁菌屬、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿隱秘桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、酵母菌、腸球菌屬(包括糞腸球菌和屎腸球菌)等15種病原菌以及葡萄球菌屬β-內(nèi)酰胺酶抗性基因進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和鑒定。結(jié)果顯示，檢測(cè)到了8種病原微生物和β-內(nèi)酰胺酶抗性基因，

表4 牛乳房炎病原菌TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

說(shuō)明引起該奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎的病原菌種類(lèi)繁多。有6個(gè)樣品檢測(cè)到弱陽(yáng)性菌，其中5個(gè)樣品中檢測(cè)到克雷伯氏菌屬，1例樣品中檢測(cè)到金黃色葡萄球菌。

克雷伯氏菌為是引起乳房炎最常見(jiàn)的環(huán)境性致病菌，同時(shí)也是人類(lèi)肺炎、支氣管炎和敗血癥等疾病的主要病原菌。杜琳等[9]研究表明克雷伯氏菌引起乳房炎的情況呈嚴(yán)重趨勢(shì)，且有不同程度的耐藥性。金黃色葡萄球菌為奶牛乳房炎主要的傳染性致病菌，一般定殖在皮膚傷口和痂皮處，可以通過(guò)角蠅、擠奶過(guò)程傳播給其他健康牛只，通常引起奶牛的最急性乳房炎或隱性乳房炎[10]，且因其極易產(chǎn)生耐藥性，所以這種菌一旦感染牛只，就不可能清除[11]。

4 小 結(jié)

通過(guò)本次試驗(yàn)，證實(shí)了分離培養(yǎng)的方法不能全面地反映引起乳房炎的細(xì)菌狀況, 必須借助分子生物學(xué)方法進(jìn)行分析。通過(guò)TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR發(fā)現(xiàn)造成奶牛乳房炎發(fā)病的病原微生物較多，一般為混合感染，所以在臨床上治療上，除了選用我們篩選過(guò)的敏感藥物以外，還要選用一些弱陽(yáng)性的病原菌的敏感藥物進(jìn)行混合使用，并定期更換藥物。同時(shí)根據(jù)檢測(cè)到的病原菌具有接觸傳染型病原菌和環(huán)境型病原菌的特點(diǎn)，奶牛場(chǎng)應(yīng)從加強(qiáng)擠奶前后乳頭的消毒，減少交叉感染和做好糞便處理、衛(wèi)生消毒，保持環(huán)境清潔、干燥，減少病菌的存在兩個(gè)方面來(lái)控制乳房炎的發(fā)生。