旋覆花治療胃食管反流病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

張淵，喻斌

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃內(nèi)容物反流造成的一系列癥狀及并發(fā)癥，通常反流至食管、咽喉，也有部分患者可反流至氣管和肺[1]。臨床多表現(xiàn)為反酸、胃灼熱、吞咽困難等消化道癥狀[2]，也有表現(xiàn)為慢性咳嗽、哮喘，或咽部異物感、聲嘶等，也可導(dǎo)致食管及胃食管癌變[3]。由于現(xiàn)代社會工作節(jié)奏快，飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣不規(guī)律，精神壓力大，導(dǎo)致該病在城市發(fā)病率明顯升高[4]。該病起病隱匿，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上以抑酸護(hù)胃為主，因臨床癥狀多，用藥常伴隨藥物不良反應(yīng)，患者依從性低等問題。

中醫(yī)根據(jù)臨床癥狀，將GERD歸屬于“食管癉”“噫醋”“吐酸“等范疇[5]?！杜R證指南醫(yī)案·脾胃》曰：“脾宜升則健，胃宜降則和”。若因飲食、勞倦、情志所傷，致使中焦土虛木旺、或痰阻氣逆、脾胃氣機(jī)升降失調(diào)、胃氣不降反逆，出現(xiàn)反酸、胃灼熱等，發(fā)生GERD。該病關(guān)鍵病機(jī)主要在于胃失和降、胃氣上逆[6]，治療多以“和胃降逆”為主，并隨癥加減。臨床常用旋覆花、枳殼、厚樸、代赭石等降胃氣，或用大黃、沉香、烏藥等通降腑氣的中藥。名中醫(yī)周亨德在治療GERD時常取旋覆花配合代赭石、姜半夏等和胃降逆[7]。筆者在跟隨導(dǎo)師喻斌教授學(xué)習(xí)過程中發(fā)現(xiàn)，老師運用旋覆花治療胃氣逆導(dǎo)致的噯氣、嘔吐、反酸等及肝氣逆導(dǎo)致的脅痛有一定療效。

旋覆花為菊科植物旋覆花或歐亞旋覆花的頭狀花序，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中稱之為“金沸草”，味苦、辛、咸，性溫，歸肺、大腸經(jīng)，具有降氣、消痰、行水的功效。清代黃元御《長沙藥解》中言：“凡草木之味，咸者絕少。咸皆治下，咸而能治上焦者尤少。惟此味咸而治上，為上中二焦之藥”。運用旋覆花降之特性來治療胃氣上逆之證，符合中醫(yī)辨證施治的特點。旋覆花的化學(xué)成分主要有倍半萜類、黃酮類和糖類，其具有抗炎、抗細(xì)胞增殖、抗氧化等藥理作用。但旋覆花治療GERD的具體作用機(jī)制少見報道。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析旋覆花治療GERD作用機(jī)制，為其在臨床的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape(3.7.0版)；蛋白質(zhì)相互作用平臺(UniProt數(shù)據(jù)庫，https：//uniprot.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http：tcmspw.com/tcmsp.php)；功能性蛋白連接網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫STRING(11.0版本，https：//string-db.org/cgi/input.pl)；注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/)；藥物銀行(DrugBank，https：//www.drugbank.ca/)；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)；治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD)；Genecards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)。

1.2 方法

1.2.1 旋覆花的活性成分篩選及其作用靶點預(yù)測 在TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“旋覆花”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%、藥物類藥性(drug-likeness，DL)值≥0.18，獲得旋覆花的活性成分。點擊進(jìn)入“Related Targets”界面，獲得旋覆花活性成分對應(yīng)的作用靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將作用靶點的名稱轉(zhuǎn)化為基因名。運用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)圖，以“節(jié)點”表示活性成分和預(yù)測靶蛋白，以“邊”表示成分與靶點之間的作用關(guān)系，可視化分析活性成分-預(yù)測作用靶點相互作用的關(guān)系。

1.2.2 檢索GERD的相關(guān)靶點 以“Gastroesophageal Reflux”和“Gastro esophageal Reflux Disease”為關(guān)鍵詞，在DrugBank、OMIM、TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索當(dāng)前已知的與GERD發(fā)病明確相關(guān)的基因靶點。

1.2.3 構(gòu)建旋覆花-GERD靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)和篩選關(guān)鍵基因(Hub) 將1.2.1所得的藥物預(yù)測作用靶點和1.2.2所得的GERD疾病靶點分別導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇對象為“Homo sapiens”，對蛋白互作拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基因節(jié)點進(jìn)行拓展，建立PPI互作網(wǎng)絡(luò)。運用Cytosecape軟件中的“merge”功能，將上述得到的兩個網(wǎng)絡(luò)提取交集，得到旋覆花治療GERD直接或間接靶標(biāo)蛋白及其互作網(wǎng)絡(luò)。運用Cytoscape軟件中的“cytohubba”插件，對旋覆花治療GERD直接或間接靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)采用MCC、MNC、中心度值及中介中心性值算法，選“Top10”，分別獲得得分前10的基因，并對這4組基因取交集，即為旋覆花治療GERD的關(guān)鍵靶點(Hub基因)。

1.2.4 旋覆花治療GERD靶標(biāo)蛋白GO分析及KEGG通路富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫，對1.2.3所得Hub基因進(jìn)行GO功能分析及KEGG通路分析(P<0.01)，篩選顯著性的基因并作圖。運用Cytoscape將符合條件的通路可視化，得到Hub基因-通路網(wǎng)絡(luò)圖，運用“merge”將此圖與1.2所得的活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)圖合并，得到中藥活性成分-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 旋覆花的藥物活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫，搜索得到符合條件的旋覆花活性化合物共19種，預(yù)測作用靶點393個，主要包括紅車軸草素(Pratensein)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、棕櫚酸香樹脂醇酯(amyrin Palmitate)、異熱馬酮(isoramanone)、檉柳黃素(tamarixetin)、旋覆花次內(nèi)酯(inulicin)3-[(3aS，4R，5R，8aR)-4-羥基-5，7-二甲基-3-亞甲基-2-氧代-4，5，8，8a-四氫-3aH-環(huán)庚基[b]呋喃-6-基]乙酸丙酯(3-[(3aS，4R，5R，8aR)-4-hydroxy-5，7-dimethyl-3-methylene-2-oxo-4，5，8，8a-tetrahydro-3aH-cyclohepta[b]furan-6-yl]propyl acetate)、[(3aR，4R，7aR)-5-[(1S)-4-乙酰氧基-1-甲基丁基] -6-甲基-3-亞甲基-2-氧代-3a，4，7，7a-四氫苯并呋喃-4-基]乙酸酯[(3aR，4R，7aR)-5-[(1S)-4-acetoxy-1-methyl-butyl]-6-methyl-3-methylene-2-oxo-3a，4，7，7a-tetrahydrobenzofuran-4-yl] acetate等(表1)。

表1 旋覆花的活性成分

2.2 旋覆花活性成分及其預(yù)測靶點可視化分析運用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。該圖顯示共203個節(jié)點(活性成分節(jié)點共16個和預(yù)測靶共187個)和393條邊，其中粉色代表活性成分，藍(lán)色代表預(yù)測靶點，每條邊表示活性成分與預(yù)測靶點相互作用關(guān)系。預(yù)測靶點按度值排列分為3圈(由外向內(nèi)，度值由小到大)。度值作為網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的標(biāo)準(zhǔn)之一，表2列舉了圖2 網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(度值>10)及其拓?fù)鋮?shù)。

注：粉色代表活性成分，藍(lán)色代表預(yù)測靶點圖1 中藥活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)圖關(guān)鍵節(jié)點及其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

2.3 構(gòu)建旋覆花治療GERD的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)在DrugBank、OMIM、TTD及Genecards數(shù)據(jù)庫分別搜索與疾病發(fā)病相關(guān)基因分別為109、394、7、181個，剔除重復(fù)基因后，篩選得到353個與GERD發(fā)病密切相關(guān)的靶點。將旋覆花活性成分對應(yīng)的預(yù)測作用靶點和GERD發(fā)病相關(guān)靶點產(chǎn)STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)擴(kuò)展，得到預(yù)測作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和與GERD發(fā)病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。前者顯示拓展后直接或間接預(yù)測作用靶點有706個，相互作用關(guān)節(jié)有8 543個；后者顯示拓展后與GERD發(fā)病相關(guān)直接或間接作用靶點有846個，相互關(guān)系為7 851個。運用Cytoscape軟件提取兩個網(wǎng)絡(luò)的交集，得到旋覆花治療GERD作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖2)，刪除與主網(wǎng)絡(luò)不關(guān)聯(lián)的靶點后，網(wǎng)絡(luò)顯示靶點數(shù)有138個，相互作用關(guān)系數(shù)為859條。圖中靶點按度值分度(最外圈為1～9，左側(cè)小圈為10～39，右側(cè)小圈為40～60，度值越大，靶點節(jié)點直徑越大)。

2.4 篩選旋覆花治療GERD的Hub基因運用Cytoscape軟件的“Cytohubba”插件中的MCC、MNC、中心度性及中介中心性值算法，分別獲得靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)，提取4個網(wǎng)絡(luò)的交集(表3)，獲得8個節(jié)點和28個相互作用關(guān)系(圖3)。圖示的8個靶點即為旋覆花治療GERD的關(guān)鍵靶點(Hub基因)。

圖2 旋覆花治療GERD作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 旋覆花治療GERD的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)

表3 Cytohubba插件篩選Hub基因表格

2.5 Hub基因的GO功能分析及KEGG通路分析對Hub基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析顯示，8個靶點共與80個生物學(xué)過程和57條信號通路有關(guān)，根據(jù)P<0.01進(jìn)行篩選，得到37個生物學(xué)過程與36條信號通路。旋覆花治療GERD主要涉及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、ERK1和ERK2級聯(lián)、改善基因表達(dá)、一氧化氮生物合成過程、MAP激酶活性、蛋白激酶B信號傳導(dǎo)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、衰老、調(diào)節(jié)脂質(zhì)貯存、血管生成、線粒體膜通透性的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)、連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核及對脂多糖反應(yīng)等生物學(xué)過程(圖4)。

注：X軸是Generatio，Y軸是生物過程名稱，氣泡顏色代表P值，氣泡大小代表富集基因數(shù)Count圖4 GO功能富集分析-生物過程氣泡圖

KEGG通路分析結(jié)果主要富集在丙型肝炎、乙型肝炎、癌癥信號通路、膀胱癌、炎癥性腸病、胰腺癌、百日咳、MAPK信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、HIF-1 信號通路、美洲錐蟲病、Toll樣受體信號通路、FoxO 信號通路、非酒精性脂肪肝、甲型流感、單純皰疹感染、癌癥中的蛋白多糖、瘧疾、子宮內(nèi)膜癌、軍團(tuán)菌感染、NOD樣受體信號通路、非小細(xì)胞肺癌、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒感染、膠質(zhì)瘤、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，與旋覆花治療GERD的潛在靶標(biāo)的相關(guān)性明顯。

運用Cytoscape軟件繪制通路-靶點網(wǎng)絡(luò)，將之與預(yù)測2.2所得的活性成分-預(yù)測靶點合并，得到中藥活性成分-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖5)，圖中顯示8個作用靶點，4個活性成分與36個通路及150條相互作用關(guān)系。

注：藍(lán)色代表通路名；綠色代表活性成分；紅色代表關(guān)鍵靶點圖5 中藥成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對旋覆花治療GERD的作用機(jī)制進(jìn)行研究，通過對中藥活性成分-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，旋覆花的有效活性成分是槲皮素、毛地黃黃酮、β-谷甾醇、山柰酚等。槲皮素和山柰酚都屬于植物類黃酮，且都具有降低損傷引起的氧化應(yīng)激的特性[8-9]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，有研究表明[10]，其可增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，可抑制炎性因子的釋放與聚集來保護(hù)胃食管黏膜。毛地黃黃酮，又稱木犀草素，其可下調(diào)NF-κB等多種炎癥因子的表達(dá)[11]。NF-κB信號通路的激活及上調(diào)各種炎癥因子水平，是導(dǎo)致GERD發(fā)生的一個重要原因。故筆者推測，旋覆花可能是通過抑制食管黏膜下炎癥因子表達(dá)，提高胃食管黏膜防御能力從而阻止反流發(fā)生。

旋覆花治療GERD的治療的關(guān)鍵靶點分別為JUN、STAT3、TP53、TNF、IL-6、CXCL8、EGFR和EGF。腫瘤壞死因子(TNF)參與多種炎癥疾病，能通過多種效應(yīng)激活 NF-κB信號通路，使炎癥活躍，導(dǎo)致食管和胃食管黏膜癌變[12]。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)可在胃食管反流等慢性炎癥環(huán)境中協(xié)同白細(xì)胞介素-8(IL-8)、表皮生長因子(EGFR)、表皮生長因子(EGF)等炎癥因子構(gòu)建炎癥網(wǎng)絡(luò)[13]；信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(STAT3)在炎癥網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用—催使慢性炎癥腫瘤化及促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管新生與轉(zhuǎn)移[14]；JUN在控制細(xì)胞惡變方面具有重要作用；TP53突變是胃癌最常見的基因突變之一[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，旋覆花中分離出的倍半萜內(nèi)酯二聚體(XFH-31)可以阻斷TNF-ɑ激活 NF-κB、MAPKs信號通路[16]，下調(diào) IL-6 等炎癥因子并阻止STAT3介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

根據(jù)GO分析的結(jié)果，旋覆花抗GERD的作用機(jī)制主要集中于抑制炎性細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、改善基因表達(dá)、抑制一氧化氮合成和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等，同時還與炎癥細(xì)胞的代謝密切相關(guān)。除化學(xué)損傷、炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)外，胃食管交界產(chǎn)生的一氧化氮到達(dá)細(xì)胞毒性濃度也可能促使GERD發(fā)生與惡化[17]。為進(jìn)一步了解旋覆花治療GERD可能性的通路，繼續(xù)對關(guān)鍵靶點行KEGG通路分析。結(jié)果顯示，在所有通路中，富集基因較多且與胃食管反流病機(jī)制關(guān)系較密切的有HIF-1信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、與癌癥相關(guān)的通路、NOD樣受體信號通路和幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。

胃酸或膽汁反流可導(dǎo)致胃食管黏膜血管受損，局部缺氧、缺血，易引起黏膜糜爛和潰瘍，血管再生對于損傷部位的修復(fù)尤為重要。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)可維持細(xì)胞在低氧環(huán)境內(nèi)存活，在胃食管疾病中HIF-1可激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，加速血管新生，促進(jìn)損傷黏膜的愈合[18]；另在腫瘤疾病中HIF-1也可加速腫瘤微環(huán)境內(nèi)的血管新生，加速腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[19]。Calvino等[20]研究發(fā)現(xiàn)，旋覆花提取物具有抗腫瘤微環(huán)境內(nèi)新血管生成的作用。故筆者推測，旋覆花可能通過調(diào)控HIF-1通路影響相關(guān)因子，起到修復(fù)胃食管黏膜及阻止黏膜病變惡化的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)具有促進(jìn)炎性細(xì)胞增殖、抑制凋亡等作用，包括ERK、JNK和p38三個亞族。在胃食管反流病發(fā)病機(jī)制中，p38MAPK信號通路被TNF-ɑ、酸性環(huán)境刺激或上游Toll樣受體信號通路激活后，上調(diào)IL-6、IL-8、IL-33、TNF-ɑ等炎癥因子，刺激誘導(dǎo)性一氧化氮合酶合成一氧化氮，導(dǎo)致GERD發(fā)生與惡化[21]。Toll 樣受體(TLRs)與NOD樣受體(NLRs)都是模式識別受體(PRRs)家族成員，TLRs分布于膜表面，參與細(xì)胞凋亡及免疫激活。NOD樣受體在人體上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的胞質(zhì)中廣泛存在，可介導(dǎo)多種免疫和炎癥反應(yīng)發(fā)生。Nadatani等[22]研究發(fā)現(xiàn)，胃食管反流病程中，屬于癌前病變的Barrett食管形成機(jī)制中，NLRP3炎性小體的形成發(fā)揮重要作用。TLRs可激活NF-κB通路，介導(dǎo)相關(guān)因子聚集形成炎癥小體，形成Caspase-1，上調(diào)IL-8等炎癥因子，從而引起炎癥效應(yīng)。Abdel-Latif等[23]研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌提取物(HPE)能誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB和AP-1高表達(dá)，可能間接引起賁門和食管遠(yuǎn)端的炎癥。GERD的發(fā)生與NF-κB通路的激活導(dǎo)致炎癥因子上調(diào)密切相關(guān)；王笑晴[24]研究發(fā)現(xiàn)，旋覆花中分離出的化合物JEUD-38可顯著抑制ERK、JNK和p38磷酸化，阻斷NF-κB和MAPK通路激活從而減少微生物脂多糖誘導(dǎo)的一氧化氮合酶表達(dá)和炎癥因子分泌。而筆者在研究過程中，發(fā)現(xiàn)在旋覆花治療GERD相關(guān)通路中富集靶點最多是與癌癥相關(guān)的通路。GERD可引起食管上皮中細(xì)胞周期調(diào)控基因及抑癌基因(尤其是P35)的突變，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化異常[25]，引起食管及食管癌變。TOKGUN等[26]發(fā)現(xiàn)，旋覆花提取物可通過P35引起細(xì)胞凋亡，對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生毒作用，從而抑制腫瘤。故筆者推測，旋覆花可能通過調(diào)控癌癥相關(guān)通路，影響p35基因表達(dá)，從而影響胃食管反流發(fā)生或阻斷胃食管黏膜癌變。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測旋覆花治療GERD作用機(jī)制，篩選藥物與疾病相互作用關(guān)鍵靶點，運用關(guān)鍵靶點分析作用機(jī)制，一定程度上減少了數(shù)據(jù)處理的工作量，且使網(wǎng)絡(luò)可視化更加清晰簡潔。本研究通過構(gòu)建“活性成分-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)”，發(fā)現(xiàn)旋覆花治療GERD可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、毛地黃黃酮等活性成分作用于 JUN、STAT3、TP53、TNF、IL6、CXCL8、EGFR 和EGF等關(guān)鍵靶點及調(diào)節(jié)HIF-1信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路及與癌癥相關(guān)等信號通路發(fā)揮直接或間接的治療作用，主要集中于促進(jìn)細(xì)胞凋亡、下調(diào)炎癥因子、調(diào)控血管生成、抑制細(xì)胞增殖和一氧化氮生成、阻止黏膜病變惡化等方面。