大氣CO2濃度升高對寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物功能多樣性及碳源利用特征的影響*

謝 云 郭芳蕓 陳麗華 曹 兵

(寧夏大學農(nóng)學院 銀川 750021)

據(jù)IPCC報告(趙宗慈等， 2018)，2011年達到390.5 μmol·mol-1，設在美國夏威夷莫納羅阿島上的測量站測得的數(shù)據(jù)顯示(Wangetal.， 2019)，2018年5月大氣中CO2濃度達到415 μmol·mol-1。大氣 CO2濃度升高已經(jīng)成為全球關注的熱點問題之一。CO2濃度升高主要通過影響植物的生長進而間接影響土壤微生物的群落和結構，會引起植物-土壤-微生物群落以及整個陸地生態(tài)系統(tǒng)的功能性改變(Rieretal.， 2005;Delgado-Baquerizoetal.， 2017)。

土壤是自然界物質(zhì)循環(huán)的重要基地，而土壤微生物是土壤的重要組成之一(Muelleretal.， 2018)。土壤微生物多樣性在維持多種生態(tài)系統(tǒng)功能方面起著重要作用，如固氮作用、硝化反硝化作用、腐殖質(zhì)分解和合成作用以及養(yǎng)分循環(huán)和對溫室氣體排放的調(diào)節(jié)作用(McFarlandetal.， 2013； Williamsetal.，2000； 徐國強等， 2002)。因此，了解土壤微生物多樣性及其活動狀況具有重要意義，但是目前有關土壤微生物群落在全球氣候變化環(huán)境背景下的驅(qū)動因素、變化規(guī)律和機制尚需深入研究。

大氣-植物相互影響方面已有諸多研究，如高CO2濃度對水稻(Oryzastiva)(Terrer, 2018)、黑麥草(Loliumperenne)(馬紅亮等， 2010)等的光合碳分配產(chǎn)生影響，從而使植物葉片中碳的增幅最顯著，其次為根、莖； 但對地下以及與地上部分之間的耦合關系的研究少有報道，特別是微生物主導的碳氮循環(huán)過程對全球氣候變化的反饋機制仍是研究的難點之一。大氣CO2濃度升高對于草本植物土壤微生物群落影響的研究較多((Dijkstraetal.， 2011； Rilligetal.， 1998； 王立， 2006)，而對于木本植物土壤微生物群落及功能多樣性的研究較為缺乏。

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬多年生落葉灌木(牛燕，2005)，具有適應性強、果實營養(yǎng)價值高、藥理作用明顯的特點，是典型的藥食同源植物(劉賽等， 2019)，在寧夏、甘肅、山西、內(nèi)蒙古、山西、河北等地均有分布和栽培(徐常青等， 2014； 馬海軍等， 2015)， 其中以‘寧杞1號’品種栽培面積最大。前期研究發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高對寧夏枸杞果實糖類、代謝產(chǎn)物及調(diào)控糖代謝基因產(chǎn)生影響，總糖、類胡蘿卜素含量顯著下降，黃酮含量顯著升高，糖代謝基因顯著上調(diào)，表明CO2濃度升高對寧夏枸杞生理代謝產(chǎn)生顯著影響(Maetal.， 2019; 哈蓉等， 2019)。目前對寧夏枸杞根際微生物功能調(diào)控方面未有報道。本研究利用BIO-ECO生態(tài)板技術(Zhangetal.， 2014)對不同CO2濃度的寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落以及土壤微生物對不同碳源的代謝能力進行研究與分析，旨在揭示隨著CO2濃度的增加，不同時期寧夏枸杞土壤微生物對碳源的利用特性以及土壤微生物的動態(tài)變化規(guī)律，為揭示枸杞栽培土壤微生物群落對氣候變化的響應提供參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計 試驗于2019年3—10月在寧夏大學實驗農(nóng)場進行，供試材料為寧夏枸杞‘寧杞1號’1年生扦插苗。

本試驗為單因素設計，設置自然環(huán)境大氣CO2濃度[CK，(400±20) μmol·mol-1]、0.5倍增大氣CO2濃度[TR1，(600±20) μmol·mol-1]、1倍增大氣CO2濃度[TR2，(800±20) μmol·mol-1]3個處理，每處理設3次重復，采用開頂氣室(open-top chamber，OTC)來控制模擬CO2濃度水平(馬亞平等， 2019)，共9個氣室，每氣室種植9株‘寧杞1號’扦插苗。自2019年5月起，對氣室進行CO2通氣處理(每日8： 00—20： 00，共12 h)(郭芳蕓等， 2019)。

1.2 土壤樣品采集 CO2通氣處理后30，60，90，120天在各氣室內(nèi)采用五點取樣法取0～40 cm土樣，48 h內(nèi)進行BIOLOG功能多樣性分析，試驗處理前取樣測定做樣地土壤理化性質(zhì)分析(表1)。

表1 各樣地土壤基本理化性質(zhì)①Tab.1 Soil physical and chemical properties of samples

1.3 土壤微生物功能多樣性測定 BLO-ECO微平板接種方法(曹宏杰等， 2019)，將接種好的微平板置于25 ℃恒溫箱進行培養(yǎng)，每隔12 h用酶標儀讀取590 nm下的吸光度，連續(xù)測定7天。

微生物整體活性指標采用微平板每孔顏色平均變化率(average well color development，AWCD)來描述(鄧嬌嬌等， 2018)，Shannon，Simpson，McIntosh等多樣性指數(shù)計算公式如下：

平均吸光度AWCD：

AWCD=∑(Ai-AA1)/31。

式中：Ai為第i孔的吸光值，AA1為A1孔的吸光值，Ai-AA1為負值時則歸0。

Shannon指數(shù)H′：

H′=-∑Pi×ln(Pi) ；

Simpson指數(shù)D：

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率。

McIntosh指數(shù)U：

式中：ni為第i孔的相對吸光值。

McIntosh均一度E：

式中：N為相對吸光值的總和，S為發(fā)生顏色變化的孔的數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)計算與整理，數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 21.0進行單因素方差分析、Duncan多重比較，數(shù)據(jù)以均值±標準誤進行統(tǒng)計。利用Origin2018進行主成分分析并作圖。

2 結果與分析

圖1 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物 AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化Fig. 1 Changes of soil microorganism AWCD in root zone of wolfberry under elevated CO2 with culture time A:處理30天時AWCD值變化AWCD value change of treatment for 30 d； B: 處理60天時AWCD值變化AWCD value change of treatment for 60 d； C: 處理90天時AWCD值變化AWCD value change of treatment for 90 d； D: 處理120天時AWCD值變化AWCD value change of treatment for 120 d.

2.1 大氣CO2濃度升高對寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落代謝活性的影響 BIO-ECO生態(tài)板的平均顏色變化率(average well color development，AWCD)是指通過土壤微生物對碳源的代謝過程中產(chǎn)生的酶與顯色物質(zhì)發(fā)生顏色反應變化來表現(xiàn)出土壤微生物群落的整體活性，也表示對各種碳源的整體利用情況(黨雯等， 2015)。由圖1可知，AWCD值隨著培養(yǎng)時間的增加迅速升高，生長趨勢呈“S型”增長，表明土壤微生物在不斷利用碳源，直到培養(yǎng)至144 h 后變化趨于平緩，說明寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落在36～144 h培養(yǎng)時間內(nèi)代謝活性最強。不同CO2濃度處理之間土壤微生物活性具有差異，土壤微生物群落代謝活性變化的總趨勢為： 自然環(huán)境大氣CO2濃度<0.5倍增CO2濃度<1倍增CO2濃度，說明在3個處理中1倍增CO2濃度處理下的土壤微生物群落具有最強的代謝能力。

由圖2可知，在CO2通氣處理30、60、90、120天時，AWCD的曲線高度從自然環(huán)境CO2濃度、0.5倍增CO2濃度、1倍增CO2濃度依次升高，且呈遞增趨勢。其中處理60天時的AWCD值均為最高，表明其對碳源的利用量最多，微生物代謝活性最強，處理90天時次之； 而處理120天時寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物代謝活性最弱。寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落在7月(處理60天)活性最強，9月(處理120天)活性最弱。

圖2 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤 微生物的活性隨處理時間的變化Fig. 2 Changes of soil microbial activity in the root zone of wolfberry under the treatment of elevated CO2 with treatment time

2.2 大氣CO2濃度升高對寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響 多樣性指數(shù)越大則表明，土壤微生物群落多樣性越高(王超群等， 2019)。由表2可知，不同CO2濃度處理之間土壤微生物群落代謝活性差異顯著，對碳源利用能力的順序為1倍增大氣CO2濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度； 而土壤微生物物種豐富度Shannon 指數(shù)、優(yōu)勢度Simpson指數(shù)均為1倍增濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度，但是1倍增和0.5倍增大氣CO2濃度處理之間無顯著差異，但均顯著高于對照。McIntosh 指數(shù)為1倍增濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度，0.5倍增相比于1倍增CO2濃度差異不顯著。以上結果表明，1倍增CO2濃度寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落多樣性顯著高于自然環(huán)境CO2濃度。

根據(jù)處理時間的差異來看，寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落均勻度指數(shù)McIntosh變化趨勢與物種豐富度指數(shù)Shannon相似，整體呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢。處理60天和90天時McIntosh 指數(shù)最高，處理120天時 McIntosh 指數(shù)最低，Simpson指數(shù)除處理60天時無顯著差異，其他時間段均有顯著差異。

2.3 大氣CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落碳代謝指紋圖譜分析 BIO-ECO微平板共具有31種碳源，其中主要分為單糖、糖苷、聚合糖等糖類，氨基酸類，酯類，醇類，胺類以及酸類6大類(錢明媚，2015)。根據(jù)不同CO2濃度處理的寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對6大類碳源的利用程度進行分析，由圖3可知，土壤微生物利用率較大的碳源主要為氨基酸類、酯類和胺類，而糖類和酸類利用率較低，說明氨基酸類、酯類和胺類是寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落利用并轉化的主要碳源。

AWCD>1.5的碳源，自然環(huán)境大氣CO2濃度處理有12種碳源，占總碳源數(shù)的38%； 0.5倍增CO2濃度處理有11種，占總碳源數(shù)的35.48%； 而1倍增CO2濃度則具有17種，占總碳源數(shù)的54.84%，說明大氣CO2濃度升高土壤微生物群落對于碳源的利用類型增多。不同大氣CO2濃度處理下土壤微生物群落對L-天冬酰胺酸、D-甘露醇、L-絲氨酸、L-天冬酰胺酸、乙基胺、4-羥基苯甲酸和吐溫-40的利用強度較大。1倍增大氣CO2濃度處理下，土壤微生物群落對L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、吐溫-40、苯乙基胺和4-羥基苯甲酸等的利用代謝能力顯著高于對照，而自然環(huán)境大氣CO2濃度下土壤微生物群落對于γ-羥基丁酸的利用代謝能力顯著高于CO2升高的處理。

表2 CO2濃度升高下土壤微生物功能多樣性指數(shù)Tab.2 Functional diversity index of soil microbes under elevated CO2

2.4 大氣CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落代謝多樣性類型主成分分析 在BIO-ECO生態(tài)板中，碳源在主成分上的載荷值越高，則表示該種碳源對主成分的影響越大。如表3所示，對主成分1( PC1) 貢獻率大的碳源10種，其中，糖類1種，氨基酸類2種，酯類2種，醇類1種，酸類3種，與 PC1正相關程度最高的碳源為D-氨基葡萄糖酸(0.238)，L-苯基丙氨酸(0.237)次之。對主成分2( PC2) 貢獻率大的碳源為2種糖類碳源，分別是β-甲基-D-葡萄糖苷和α-D-乳糖，與PC2 正相關程度最高的碳源為β-甲基-D-葡萄糖苷(0.243)。利用PC1和PC2主成分將不同時期下土壤微生物群落劃分而起分異作用的主要碳源是糖類和胺類，這可能是植株、土壤養(yǎng)分與土壤特征微生物等相互作用的結果。

利用培養(yǎng)144 h的AWCD值，對3個處理和4個處理時期的土壤微生物碳源利用特性進行主成分分析(圖4)，其中β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙?；?D-葡萄胺3種碳源主成分累計貢獻率為31.0%，其中4個時期的PC1方差貢獻率分別為72.95%，63.84%，66.00%，63.96%； PC2的方差貢獻率分別為27.05%，36.12%,34.00%，36.04%。

由圖4和表3可知，30 d-PC1正軸方向分布的0.5倍增和1倍增大氣CO2濃度，碳源利用主要為氨基酸類、酯類和酸類，在30 d-PC2正軸方向分布的1倍增和自然環(huán)境大氣CO2濃度，6類碳源均有利用，其中酯類利用率最高。60 d-PC1正軸方向分布的自然環(huán)境和1倍增CO2濃度，利用的碳源主要為糖類、酯類和酸類，在60 d-PC2正軸方向分布的為1倍增CO2濃度，主要利用酯類和酸類。90 d-PC1正軸方向為1倍增CO2濃度，碳源均有利用，而90 d-PC2正軸方向則為0.5倍增和自然環(huán)境CO2濃度，前者主要利用酯類碳源，而后者則為氨基酸類碳源，其他碳源利用類似。處理120天同處理90天。

表3 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物PC1、PC2的碳源主成分載荷因子Tab.3 Carbon sources loading factors of PC1 and PC2 of PCA in the root zone of wolfberry under elevated CO2

圖4 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物碳源利用主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of carbon source utilization in the root zone of wolfberry under elevated CO2

3 討論

土壤微生物功能多樣性是指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過程，例如分解、營養(yǎng)傳遞以及促進或抑制植物生長的功能(賈夏等， 2013； 雷霆等， 2007)。本研究表明，大氣CO2濃度的增加對土壤微生物群落的活性產(chǎn)生顯著影響，這與徐國強等(2002)和Williams等(2000)的研究結果相似，但與Ronn等(2002)和Carrillo等(2018)認為的CO2濃度升高對微生物群落結構影響不顯著的結果不同。從理論上來說，自然環(huán)境大氣CO2濃度分直接和間接來影響土壤微生物群落的活性和變化，直接影響主要為植株通過光合作用將CO2同化成有機物并將其運輸至根系(王苑，2014)，根系通過分泌和死亡的方式將更多的營養(yǎng)和能源供給微生物群落，從而引起土壤微生物分解速率和活性增強，生物量增加； 而土壤呼吸作用、土壤理化性質(zhì)、植物凋落物數(shù)量等都是影響微生物群落活性和變化的間接因素(Dijkstraetal.， 2011)。Williams等(2000)研究表明，自然環(huán)境大氣CO2濃度的增加會影響植物葉片某些化學成分的變化(非結構C的增加)，從而導致葉片中其他物質(zhì)含量的變化，主要為N含量的減少和次生代謝物質(zhì)的增加，導致植物凋落物組成成分發(fā)生變化，碳氮比增加，土壤微生物分解活動增大，導致土壤微生物活性的增大。

土壤中 CO2濃度遠遠高于自然環(huán)境大氣中的濃度，大氣 CO2濃度的升高會引起土壤中碳源供應能力、水分和養(yǎng)分有效性發(fā)生變化,能顯著影響土壤微生物的群落和功能，土壤微生物群落的變化不僅與植物和土壤中的養(yǎng)分有關，而且與溫度、空氣、濕度及其他因素有著一定的聯(lián)系(Zaketal.， 2000)。Liu等(2017)研究指出，土壤中細菌的數(shù)量級遠遠大于真菌，在有機物轉化的過程中占有相當大的比重，對于根周轉加速、根系分泌物的分解轉化等養(yǎng)分循環(huán)起著重要作用。物種多樣性指數(shù)是表征土壤中微生物群落的物種豐富度及其優(yōu)勢物種度和分布均勻程度的常用指數(shù)，其中最常見的3種指數(shù)為Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)，分別從不同角度反映土壤微生物群落的功能多樣性(鄧嬌嬌等， 2018)。從上述分析可以得出，大氣CO2濃度升高能使土壤微生物群落的物種豐富度、物種優(yōu)勢度及群落均勻度增加，但是隨著處理時間的增加，不同CO2濃度處理間土壤微生物的物種優(yōu)勢度逐漸減小，這可能是由于土壤微生物群落到處理后期對高濃度CO2具有了適應能力。目前，國內(nèi)外利用BIO-ECO板來分析微生物群落的多樣性的同時，很少考慮培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間以及樣品處理等因素，其中，賈夏等(2013)、黨雯等(2015)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間和樣品預處理的不同在多樣性指數(shù)、碳源利用率均存在著差異。

在整個研究過程中，寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落所利用的碳源主要為氨基酸類、酯類和胺類，而對糖類和酸類利用率較低。氨基酸類為土壤有機氮的主要來源，植物無法直接利用含氮有機物中的氮素，必須先經(jīng)過微生物分解之后才能吸收;酯類和胺類則為土壤中最重要的有機成分(楊美玲等， 2018)。這一結果可能與寧夏枸杞根系分泌物具有一定的關系。根據(jù)Zak等(2010)關于CO2濃度升高對植物影響的47個研究進行綜合分析顯示，CO2濃度升高會對植物生產(chǎn)力，植物根系有機酸、可溶性糖和有機酸等化合物的分泌有著巨大的改變，從而改變土壤微生物群落，使其提高土壤和微生物的呼吸速率。在31種碳源中，β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙?；?D-葡萄胺3種碳源是大氣CO2濃度升高后導致土壤微生物群落變化的敏感碳源。土壤微生物代謝功能類群有不同的碳源利用能力，植物的根系分泌物不同，所以導致其土壤微生物所利用的碳源也有所不同。

綜上所述，大氣CO2濃度升高可促進寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物功能多樣性，可提高其碳源利用率，并改變部分碳源利用類型。本研究為寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物在氣候變化背景下的受大氣CO2濃度升高影響提供了一部分生理生化信息，為寧夏枸杞的培育和田間管理提供一定理論參考和技術支撐。

4 結論

通過大氣CO2濃度升高對寧夏枸杞1個生長季土壤微生物群落功能多樣性的研究，可獲得以下結論： 1倍增大氣CO2濃度處理寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對31種碳源的平均利用率和4種多樣性指數(shù)均最高，自然環(huán)境大氣CO2濃度處理最低。寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對氨基酸類、酯類和胺類碳源利用率較高，而糖類和酸類利用率較低，說明氨基酸、酯類和胺類碳源是寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落利用并轉化的主要碳源。

大氣CO2濃度升高均能使微生物群落的活性及碳源利用率明顯增加，隨著處理時間的延長，土壤微生物群落活性逐漸增強直至處理60天(7月份)后減弱，處理120天(9月份)時寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落活性最弱。根據(jù)寧夏地區(qū)的氣候條件分析，這可能與微生物群落對于溫度較高、濕度較高的環(huán)境適應力較高有關，尤其細菌。