張雨，陳愛華，吳楊平，曹奕，陳素華，張志東,2，田鎮(zhèn),2，李秋潔,2

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

大竹蟶Solen grandis 俗稱蟶子王，是廣泛分布我國沿海的經(jīng)濟貝類之一，在江蘇呂四漁場內(nèi)如東、啟東一線歷來具有相當?shù)馁Y源量。但近年來圍填海和港口建設等因素不同程度影響了海洋生境，大竹蟶呼吸代謝狀態(tài)受到嚴重挑戰(zhàn)。本課題組嘗試進行大竹蟶池塘養(yǎng)殖。轉(zhuǎn)向池塘養(yǎng)殖的大竹蟶因養(yǎng)殖地點的不同，海水鹽度、溫度及pH 等也存在顯著差異。研究表明，鹽度影響水生動物鰓纖毛運動和心臟的跳動[1,2]；溫度和pH 變化改變了生物體內(nèi)各種酶的活力，影響水生動物的呼吸代謝[3,4]。耗氧率和排氨率是反映水生動物呼吸代謝的重要指標，估算貝類養(yǎng)殖容量的重要參數(shù)[5]。目前有關魚類[6-8]、甲殼類[9,10]及貝類[11-14]耗氧率和排氨率的研究均有報道。然而目前僅限于單一環(huán)境因素的研究，較少考慮環(huán)境因素的聯(lián)合作用。而研究多種環(huán)境聯(lián)合條件下大竹蟶的呼吸代謝狀況，對大竹蟶池塘健康養(yǎng)殖具有積極意義。

響應面法是一種解決多變量問題的數(shù)學統(tǒng)計分析方法，主要通過提供合理的試驗設計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、評價多種變量之間的交互作用而建立數(shù)學模型和三維立體響應曲面圖形，最終得出最優(yōu)參數(shù)組合的多元回歸方程[15-17]。目前響應面法已較多地運用在工藝優(yōu)化和藥物研發(fā)等領域[18]，而在水產(chǎn)動物中的運用研究較少。本研究利用響應面法研究鹽度、溫度和pH 三因素及其聯(lián)合效應對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，利用多元回歸方程模擬出大竹蟶耗氧率及排氨率最高時的養(yǎng)殖條件，以期為大竹蟶養(yǎng)殖條件優(yōu)化、人工苗種繁育和增殖放流提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大竹蟶平均體質(zhì)量（5.42±0.23）g，取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所文蛤良種場，選取規(guī)格相似，健康無損的個體在聚乙烯水槽中暫養(yǎng)7 d，投喂105ind·mL-1的球等鞭金藻Isochrysis galbana，每日換水一次，實驗開始前停喂1 d。

1.2 單因素實驗

1.2.1 鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

參照朱曉聞[4]等試驗方法，實驗在聚乙烯桶中的恒溫密閉呼吸瓶中進行，每個桶中放3 個大竹蟶，溫度為26℃，pH 為7.82。用沙濾海水、海水晶和淡水將鹽度調(diào)節(jié)為22、25、28、31 和34，設3 個重復。實驗在白天進行，持續(xù)2 h，分別用溶氧儀和氨氮測定儀測定初始和結(jié)束時呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮濃度。實驗結(jié)束時在精確度0.0001 g 的電子天平上精確稱量大竹蟶總重。

1.2.2 溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設5 個溫度梯度：20℃、23℃、26℃、29℃和32℃，每個溫度設3 個重復，室溫為26℃，采用冰塊或加熱板調(diào)節(jié)溫度，實驗鹽度為28，pH 為7.82。實驗裝置及方法同1.2.1。

1.2.3 pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設5 個pH 梯度：7、7.5、8、8.5 和9，每個pH 設3 個重復，室溫為26℃，通過添加NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)至相應pH。實驗鹽度為28，溫度為26℃。實驗裝置及方法同1.2.1。

1.3 多因素實驗

在單因素實驗的基礎上，以大竹蟶耗氧率和排氨率為指標，運用Box-Behnken 模型，選擇三因素三水平的中心組合方案，以鹽度、溫度和pH 為主要考察因素，進行響應面實驗，實驗因素水平編碼見表1，實驗裝置及方法同1.2.1。

表1 因素水平表Tab.1 The design table of factors and levels

1.4 耗氧率及排氨率的測定

分別用YSI 溶氧儀和次溴酸鈉氧化法測定初始和結(jié)束時呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮含量。耗氧率OC 及排氨率AE 的計算公式如下：

式中：OC 為單位大竹蟶體質(zhì)量的耗氧率（mg·g-1·h-1），DO0和DOt分別為實驗開始和結(jié)束時水中的溶解氧量（mg·L-1），AE 為單位體質(zhì)量的排氨率（μg·g-1·h-1），N0和Nt分別為實驗開始和結(jié)束時水中NH4+-N 含量（mg·L-1），V 為呼吸瓶體積（L），W 為大竹蟶總重（g），t 為實驗時間（h）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果均以平均值±標準差（Mean±SD）表示。單因素實驗數(shù)據(jù)用Excel2016 進行整理，用SPSS19.0 進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，最后用Origin8.0 作圖。多因素實驗根據(jù)Design-expert 8.0 軟件中BBD 模型設計，用該軟件進行二元二次多項式回歸分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖1 可知，鹽度顯著影響大竹蟶耗氧率與排氨率（P＜0.05），鹽度22～28 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均呈上升趨勢，在鹽度為28 時均達到最大值，OC=（0.48±0.10）mg·g-1·h-1，AE=（38.32±5.21）μg·g-1·h-1；鹽度超過28 時，耗氧率及排氨率均呈下降趨勢。單因素方差分析表明，鹽度28 時，顯著高于在鹽度22 與34 時的耗氧率（P＜0.05），與鹽度25和31 時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；排氨率在鹽度28 時，顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）。

圖1 不同鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.1 Effects of different salinities on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.2 溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

不同溫度下，大竹蟶耗氧率及排氨率如圖2 所示：在20～26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率均隨溫度的升高而增加；在26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率達峰值，OC=（0.49±0.07）mg·g-1·h-1，AE=（39.13±3.23）μg·g-1·h-1；超過26℃后，大竹蟶耗氧率及排氨率呈下降趨勢。單因素方差分析表明，26℃時顯著高于20℃、29℃及32℃的耗氧率（P＜0.05），與23℃時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；溫度26℃時，排氨率顯著高于其他溫度組（P＜0.05）。

圖2 不同溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.2 Effects of different temperature on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.3 pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖3 可知：pH 為7.0～8.0 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均pH 的升高而升高；在pH 為8.0 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均達到峰值，OC=（0.49±0.04）mg·g-1·h-1，AE=（36.25±6.23）μg·g-1·h-1；超過8.0后，大竹蟶的耗氧率及排氨率下降。單因素方差分析表明，pH 為8 時，大竹蟶的耗氧率及排氨率顯著高于pH 為8.5 和9 時（P＜0.05），與pH7 和7.5 時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；pH 為8 時，顯著高于在pH 為7、7.5 及9 時的排氨率（P＜0.05），與pH8.5時的排氨率差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.3 Effects of different pH values on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.2 多因素實驗響應面法分析

按照BBD 設計了17 組多因素實驗，通過RSM建立回歸模型，并對回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗。結(jié)果顯示，大竹蟶耗氧率及排氨率回歸模型的F 值分別為149.49 和465.47，P-value 均小于0.0001，表明BBD 優(yōu)化法可靠，變量對響應值的影響極為顯著，模型具有統(tǒng)計學意義。其次，兩個模型的擬合系數(shù)（R2）分別為0.9948 和0.9983，說明模型預測值與實測值擬合度高。校正決定系數(shù)（Adj R2）分別為0.9882 和0.9962，均可解釋數(shù)據(jù)變異性的85%以上。精密度（Adeq Precisior）均大于25%，回歸模型可準確用于結(jié)果分析。由表3 可知，溫度一次效應對大竹蟶耗氧率的影響不顯著（P＞0.05）；鹽度和pH 一次效應對大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）；鹽度、溫度及pH 交互效應對大竹蟶耗氧率影響不顯著（P＞0.05），鹽度、溫度及pH 二次效應對大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）。因此需要剔除交互作用項，然后對模型重新進行回歸。根據(jù)方差分析結(jié)果得出大竹蟶耗氧率OC 與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項回歸方程。大竹蟶預測值OC 對編碼值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：OC=0.48-8.75×10-3A-5×10-3B-0.011C-0.088A2-0.1B2-0.098C2；大竹蟶預測值OC 對實際值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：OC=-39.51+0.56A+0.56B+6.27C-9.72×10-3A2-0.01B2-0.39C2。

由表4 可知，鹽度及pH 一次效應對大竹蟶排氨率的影響顯著（P＜0.05），溫度對大竹蟶排氨率的影響不顯著（P＞0.05）；溫度與鹽度、鹽度與pH 交互效應大竹蟶排氨率影響不顯著（P＞0.05），溫度與pH交互效應對大竹蟶排氨率影響顯著（P＞0.05）；鹽度、溫度及pH 二次效應對大竹蟶排氨率影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)方差分析結(jié)果得出大竹蟶排氨率AE與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項回歸方程大竹蟶預測值AE 對編碼值自變量A、B和C 的二次多項回歸方程。

表2 實驗設計與結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design with the observed responses

表4 大竹蟶排氨率回歸模型方差分析Tab.4 ANOVA for the regression model of ammonia excretion rate (AE) in razor clam Solen grandis

大竹蟶預測值AE 對編碼值自變量A、B 和C的二次多項回歸方程為：AE=38.85+1.37A-0.30B+2.91C+0.085AB+0.19AC-0.87BC-6.75A2-7.89B2-11.54C2。

大竹蟶預測值AE 對實際值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：AE=-4238.24+41.23A+49.83B+755.92C+9.44×10-3AB+0.13AC-0.58BC-0.75A2-0.88B2-46.16C2。

根據(jù)所建立的上述數(shù)學模型，得出大竹蟶耗氧率及排氨率的最佳條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。

3 討論

鹽度對貝類呼吸和代謝有重要影響。一般認為，鹽度的改變不僅影響貝類的攝食能力，還影響鰓纖毛運動和心臟的跳動。鹽度過高或過低時，貝類會關閉進出水管，緊閉雙殼，形成組織和外部條件的隔離，呼吸和排泄減慢[1,2]。本研究結(jié)果顯示：鹽度的一次效應對大竹蟶耗氧率及排氨率影響顯著（P＜0.05）。在鹽度22～31 范圍內(nèi)，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，鹽度28 時，耗氧率與排氨率最大。這與九孔鮑Haliotis diversicolor supertexta[19]、毛蚶Scapharca subcrenata[20]、褐菖鲉Sebastisucus marmoratus[21]及黃斑籃子魚Siganus oramin[22]等耗氧率及排氨率隨鹽度變化規(guī)律一致。

溫度的變化會引起生物體內(nèi)各種酶活力的變化，影響生物的新陳代謝[3]。本實驗結(jié)果表明，溫度20～32℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率最大。這與褶紋冠蚌Cristaria plicata、背角無齒蚌Anodonta woodiana、河蜆Corbicula fluminea、銅銹環(huán)棱螺Bellamya aeruginosa 等[23]耗氧率及排氨率變化規(guī)律相同。水體pH 不僅影響水產(chǎn)動物新陳代謝，還會影響貝類血液的pH 和貝殼的分泌與形成[4]。本試驗結(jié)果表明，pH 的一次效應和二次效應對大竹蟶耗氧率和排氨率的影響極顯著（P＜0.01）。在pH 7.0～9.0 范圍內(nèi)，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，pH 為8 時，大竹蟶耗氧率與排氨率達到最大。這與縊蟶Sinonovacula constricta[5]、鯔Mugil cephalus[24]及 尖 紫 蛤Soletellina acuta[25]耗 氧率和排氨率變化規(guī)律相似。其原因可能是pH 過高或者過低均會損壞貝類鰓纖毛的組織細胞，抑制鰓纖毛的活力，不同程度影響貝類的呼吸與排泄[26]。具體分子機制還需進一步研究。

對貝類耗氧率及排氨率的研究較少考察環(huán)境因素的聯(lián)合作用及曲面效應。本試驗分析了鹽度、溫度和pH 的交互作用對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，構建的Box-Behnken 模型擬合度很高，說明該模型能很好地解釋大竹蟶耗氧率及排氨率隨環(huán)境因素的變化。研究大竹蟶呼吸代謝的最佳條件時，還應進一步考慮放養(yǎng)密度和規(guī)格、底質(zhì)條件、溶氧水平等交互作用對耗氧率及排氨率的影響。利用Design-expert 8.0 統(tǒng)計軟件分析了影響大竹蟶耗氧率及排氨率的3 個因素及其交互作用，得出大竹蟶的最佳呼吸代謝條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。在此環(huán)境條件下大竹蟶代謝旺盛，而溫度、鹽度和pH 的聯(lián)合效應對于大竹蟶生長和生理的影響還需進一步探討。