龔成宇，王 毅，2，宋海巖，3，楊 科，陶海青，劉俊宏，龔榮高*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.廣元市利州區(qū)工業(yè)集中發(fā)展區(qū)管理委員會，四川 廣元 628018；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【研究意義】黃果柑(Citruscultivarcv.Huangguogan)隸屬蕓香科(Rutaceae)柑桔屬(Citrus)，為桔橙的天然雜交種，是我國大渡河流域石棉、漢源等干暖河谷地帶特有的柑桔寶貴資源[1]。干旱脅迫是近年來植物面臨較大的環(huán)境脅迫因子之一[2]。干旱脅迫常常會對果樹的形態(tài)生理、生長發(fā)育、果實(shí)產(chǎn)量和多種內(nèi)含物的代謝過程造成極大影響，并且由于干旱脅迫程度和果樹種類的不同，所表現(xiàn)出的規(guī)律性也不相同[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】干旱脅迫對果實(shí)外在品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在果實(shí)變小、硬度增大等方面[4]。在枇杷[5]、鴨梨[6]、草莓[7]和葡萄[8]的研究中均表明果實(shí)的可溶性固形物、可溶性糖含量及糖酸比值在水分脅迫下有一定的提升，張萍等[9]在枸杞的研究中也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)母珊得{迫處理有利于果實(shí)中己糖的積累，果實(shí)產(chǎn)量降低但果實(shí)品質(zhì)變優(yōu)，姜妮等[10]與石學(xué)根等[11]對柑橘的研究表明一定的水分脅迫有利于糖分含量增加，但對果實(shí)有機(jī)酸含量的影響并不明顯，而鄧勝興[12]的研究卻表明土壤相對含水量與果實(shí)有機(jī)酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。蒲雪荔[13]研究表明，果實(shí)發(fā)育初期受到AI、SS分解作用較大，而NI(蔗糖中性或堿性轉(zhuǎn)化酶)、SS合成發(fā)揮作用的階段主要是果實(shí)發(fā)育中后期，SPS是整個果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖積累的關(guān)鍵酶；CS(檸檬酸合成酶)、PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、ACO、NAD-IDH和MDH(蘋果酸脫氫酶)均是影響柑橘果實(shí)有機(jī)酸代謝的重要酶。【本研究切入點(diǎn)】目前黃果柑的主要產(chǎn)地氣候干熱少雨，年降水量分布不均，春季干旱現(xiàn)象嚴(yán)重，黃果柑產(chǎn)業(yè)已深受當(dāng)?shù)貧夂蛴绊??！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過研究不同程度干旱脅迫下黃果柑的果實(shí)品質(zhì)變化以及糖酸代謝變化，為全面揭示干旱脅迫對黃果柑果實(shí)生長發(fā)育及糖酸代謝機(jī)制的影響提供參考，更為結(jié)合生產(chǎn)地氣候因素找到黃果柑增糖降酸以及提質(zhì)增效的產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于雅安市漢源縣小堡藏族彝族鄉(xiāng)解放村(N 29°18′,E 102°33′，海拔950 m)，地處大渡河中游干暖河谷區(qū)域，亞熱帶氣候區(qū)，少雨且不均，年均降水量在650 mm左右，土壤類型為紅壤土。供試材料為7年生晚熟黃果柑，砧木為枳殼，植株健壯、樹勢一致，常規(guī)栽培管理措施。

1.2 試驗(yàn)方法

所有材料從2018年4月開始統(tǒng)一管理，對試驗(yàn)田進(jìn)行地膜覆蓋和挖溝排水來避免降雨對試驗(yàn)處理的干擾，處理開始后每3 d用德國STEPES MST3000+型便攜式水分測定儀進(jìn)行一次土壤相對含水量的測定，通過多排少補(bǔ)的方式使各處理的土壤相對含水量于花后30 d左右開始長期處于試驗(yàn)設(shè)置的范圍內(nèi)，各處理如表1所示，以單個小區(qū)為一個處理，每個小區(qū)3株黃果柑樹體，每個處理重復(fù)3次。分別于達(dá)到干旱脅迫程度后的30 d(即花后60 d)開始對每個處理的果實(shí)進(jìn)行收集，果實(shí)的收集按照每棵樹的東、南、西、北4個方位采摘大小一致、無病蟲害且無機(jī)械損傷的黃果柑果實(shí)，此后每30 d采集一次樣品直至果實(shí)成熟，樣品采集次數(shù)共計10次。每次采集的樣品立即放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用于糖酸組分含量及糖酸代謝酶活性指標(biāo)測定的樣品果實(shí)切成對稱的4份，取每份的中間部分果肉用液氮品保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 黃果柑果實(shí)的品質(zhì) 指標(biāo)通過天平和游標(biāo)卡尺測定果實(shí)相關(guān)外觀品質(zhì)指標(biāo)，F(xiàn)R-5105型硬度計測定果實(shí)硬度?？扇苄怨绦挝锖坷檬殖质秸酃鈨x(手持式糖度計)測定，Vc含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定[14]?？扇苄钥偺呛康臏y定用斐林試劑法，有機(jī)酸總含量的測定采用NaOH中和滴定法。

1.3.2 黃果柑果實(shí)中糖酸組分含量 參照肖玉明[15]的高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行黃果柑果實(shí)糖酸的提取與測定。

1.3.3 黃果柑果實(shí)中相關(guān)糖酸代謝酶活性 黃果柑果實(shí)中相關(guān)糖酸代謝酶酶液的制備和酶活性的測定均參照龔榮高[16]的方法。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有指標(biāo)重復(fù)測定3次后取平均值。通過Microsoft Excel 2010、SPSS20.0和Origin85等平臺對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、檢驗(yàn)并繪圖。

表1 各脅迫處理的土壤相對含水量范圍

表2 干旱脅迫對黃果柑成熟果實(shí)單果重、可食率及縱橫徑的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對黃果柑成熟果實(shí)果實(shí)品質(zhì)的影響

由表2可知，黃果柑成熟果實(shí)的單果重與干旱脅迫程度表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)，果實(shí)縱、橫徑均與干旱脅迫程度表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)，但各處理間的果形指數(shù)和可食率卻以LD處理下最大，且各處理間未達(dá)到顯著差異水平。說明干旱脅迫顯著影響了黃果柑的果實(shí)大小，但對果形變化和可食率的影響并不顯著。由表3可知，黃果柑成熟果實(shí)的Vc含量和有機(jī)酸含量均隨著脅迫程度的加重而降低，而可溶性固形物含量、可溶性總糖含量及糖酸比均以LD處理下的果實(shí)最大。其中，果實(shí)的Vc含量、有機(jī)酸含量及糖酸比均在各處理間達(dá)到顯著差異水平，果實(shí)可溶性總糖含量差異達(dá)到極顯著水平，說明干旱脅迫對黃果柑果實(shí)內(nèi)含物的含量具有顯著影響，尤其表現(xiàn)在對果實(shí)可溶性糖含量的影響。

2.2 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)發(fā)育過程中糖含量的影響

由圖1可知，果實(shí)發(fā)育后期蔗糖含量明顯高于葡萄糖和蔗糖含量，說明黃果柑的糖積累以蔗糖為主。從干旱脅迫后的90 d開始，各處理間可溶性總糖含量表現(xiàn)為LD>CK>SD，直到果實(shí)完熟，LD處理的果實(shí)可溶性總糖含量較CK處理高11.45 %，而SD較CK處理則降低了6.61 %。各脅迫處理間的糖組分含量差異主要發(fā)生在果實(shí)成熟后期，蔗糖含量差異表現(xiàn)為LD>SD>CK，葡萄糖和果糖含量均表現(xiàn)出與可溶性總糖含量相一致的差異，即LD>CK>SD，說明LD處理能較大程度地提升果實(shí)中可溶性總糖及各糖組分含量，而SD處理雖然對果實(shí)中蔗糖含量有一定的提升，但降低了果實(shí)中果糖和葡萄糖的含量，從而抑制了果實(shí)可溶性總糖的積累。

2.3 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)糖代謝相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)蔗糖合成酶類活性的影響 由圖2可知，果實(shí)發(fā)育前期SS合成方向及SPS的活性在各脅迫處理間并沒有表現(xiàn)出顯著差異。自脅迫處理后的180 d開始，SS合成方向的活性在各脅迫處理間表現(xiàn)為與可溶性總糖一致的規(guī)律，即LD>CK>SD。SPS活性自脅迫處理后的180 d開始在各脅迫處理間表現(xiàn)出相對明顯的差異規(guī)律，這一差異規(guī)律與總糖積累的不同，但與各處理間蔗糖的積累差異規(guī)律一致，即LD>SD>CK，且除脅迫處理后的240 d以外，其余各時期各處理間均達(dá)到顯著差異水平，由此說明，SS合成方向是各脅迫處理間果實(shí)可溶性總糖積累后期出現(xiàn)差異的關(guān)鍵因素，而SPS則是引起各脅迫處理間果實(shí)蔗糖積累后期出現(xiàn)差異的關(guān)鍵酶。

2.3.2 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)蔗糖分解酶類活性的影響 由圖3可知，黃果柑果實(shí)發(fā)育過程中， AI和SS分解方向的活性都呈現(xiàn)出整體降低的趨勢，而后期NI活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AI，由此說明，在果實(shí)發(fā)育前期，果實(shí)形態(tài)構(gòu)建高峰需要消耗大量糖分解所提供的能量。前期，果實(shí)蔗糖分解酶類中對果實(shí)糖積累的影響主要由SS分解方向和AI活性所決定，而進(jìn)入果實(shí)膨大期以后，NI是影響糖積累的關(guān)鍵酶。從各脅迫處理間酶活性的差異來看，在整個發(fā)育過程中各脅迫處理間NI活性均未表現(xiàn)出顯著差異，而SS分解方向的活性在脅迫處理前期表現(xiàn)出一定的差異，但未達(dá)到顯著水平。由此，前期果實(shí)糖積累的過程可能與SS分解方向的活性有關(guān)。自脅迫處理后150 d開始，AI表現(xiàn)為CK>SD>LD，由此說明，在黃果柑果實(shí)蔗糖分解酶中，NI和SS分解方向的活性雖然高于AI，但是脅迫處理間的糖積累差異主要由AI造成。

表3 干旱脅迫對黃果柑成熟果實(shí)部分內(nèi)含物指標(biāo)的影響

2.4 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)發(fā)育過程中酸含量的影響

由圖4可知，黃果柑生長發(fā)育過程中檸檬酸在有機(jī)酸中占比達(dá)50 %～95 %，蘋果酸和奎寧酸后期占比極低，說明黃果柑酸代謝以檸檬酸為主。各脅迫處理下的果實(shí)檸檬酸和有機(jī)酸含量均在脅迫處理后90 d達(dá)到積累峰值，隨后便表現(xiàn)出不同程度的降解，而蘋果酸和奎寧酸均表現(xiàn)出了“L”型的降解趨勢，其降解程度表現(xiàn)為SD>LD>CK，果實(shí)成熟后期，各脅迫處理間果實(shí)有機(jī)酸和酸組分含量均表現(xiàn)為CK>LD>SD，其含量差異與降解程度相反，其中，果實(shí)成熟時SD與LD處理的果實(shí)有機(jī)酸含量分別較CK處理顯著降低，降幅達(dá)27.24 %和17.59 %，由此可以推斷果實(shí)最終有機(jī)酸含量的差異并非完全由果實(shí)有機(jī)酸的積累量所決定，而是由酸的降解程度所決定，且干旱脅迫處理有利于黃果柑果實(shí)中酸的降解。

2.5 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)有機(jī)酸代謝相關(guān)酶活性的影響

2.5.1 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)有機(jī)酸合成酶類活性的影響 由圖5可知，脅迫前期果實(shí)中CS、PEPC與MDH活性均快速升高，與有機(jī)酸含量的迅速積累保持一致，而脅迫后期除CS的活性還保持一個相對較高的狀態(tài)外，PEPC與MDH的活性則伴隨著黃果柑果實(shí)中有機(jī)酸含量的穩(wěn)定均降低到發(fā)育全程的最低水平，且這3種酶的酶活性在不同程度脅迫處理的果實(shí)間均沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)的差異規(guī)律性。由此說明，黃果柑果實(shí)中CS、PEPC和MDH的活性對果實(shí)發(fā)育前期有機(jī)酸的積累具有重要影響，但不同程度干旱脅迫間果實(shí)有機(jī)酸含量的差異并不是由CS、PEPC和MDH酶活性所決定的。

2.5.2 干旱脅迫對黃果柑果實(shí)有機(jī)酸分解酶類活性的影響 由圖6可知，細(xì)胞質(zhì)ACO和NAD-IDH均在果實(shí)發(fā)育的中后期保持著相對較高水平的活性，說明細(xì)胞質(zhì)ACO和NAD-IDH是黃果柑果實(shí)發(fā)育酸降解過程中的重要酶。在各脅迫處理間，果實(shí)中線粒體ACO全程沒有表現(xiàn)出明顯的活性差異，細(xì)胞質(zhì)ACO和NAD-IDH自脅迫處理后150 d開始，各處理間活性差異表現(xiàn)為SD>LD>CK，與各處理間果實(shí)成熟后期有機(jī)酸降解階段的降解程度差異一致。說明，有機(jī)酸降解階段細(xì)胞質(zhì)ACO和NAD-IDH是造成不同干旱脅迫處理間果實(shí)有機(jī)酸含量差異的主要酶。

3 討 論

現(xiàn)有研究認(rèn)為適度的干旱脅迫會導(dǎo)致果實(shí)變小，硬度增大，在少量降低果實(shí)有機(jī)酸含量和Vc含量的前提下能夠有利于可溶性固形物、可溶性糖的積累[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明干旱脅迫會抑制果實(shí)大小的發(fā)育，而對果形不會造成太大的影響，輕度干旱脅迫在適度降低果實(shí)外觀品質(zhì)的前提下能有效提升黃果柑的內(nèi)在品質(zhì)，而重度脅迫顯然會降低果實(shí)的整體品質(zhì)，這與前人的研究結(jié)論基本一致。糖代謝方面，輕度干旱脅迫顯著提升了黃果柑果實(shí)中可溶性總糖及糖組分含量，而重度干旱脅迫雖然提升了果實(shí)中蔗糖的含量，卻抑制了葡萄糖、果糖及可溶性總糖含量，猜想這可能是由于在重度干旱脅迫環(huán)境下，成熟期果實(shí)內(nèi)部更容易發(fā)生葡萄糖和果糖向蔗糖的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步研究表明SS合成方向的活性自脅迫處理后180 d開始與各脅迫處理間可溶性總糖含量表現(xiàn)為一致的差異規(guī)律，AI在各處理間表現(xiàn)出了與果實(shí)蔗糖含量相反的差異趨勢，結(jié)合SPS的活性差異驗(yàn)證了重度脅迫能加快果實(shí)果糖和葡萄糖向蔗糖的轉(zhuǎn)化從而提升果實(shí)蔗糖含量的猜想，但其酶活性的差異對不同程度干旱脅迫間葡萄糖、果糖以及可溶性總糖含量的差異影響并不明顯，這可能是由于其酶活性差異雖然顯著，但整體活性較低所造成的。說明SS合成方向是各脅迫處理間在果發(fā)育后期可溶性總糖含量出現(xiàn)差異的關(guān)鍵酶，而SPS和AI則是引起各脅迫處理間果實(shí)蔗糖積累出現(xiàn)差異的關(guān)鍵酶，這與曹淑燕等[19]在研究相同管理水平下株間黃果梢果實(shí)糖含量差異所找到的影響關(guān)鍵酶所一致。柑橘酸代謝方面，Yamaki[20]研究發(fā)現(xiàn)10余種柑橘有機(jī)酸組分，但大部分柑橘以檸檬酸代謝為主，本研究表明黃果柑果實(shí)有機(jī)酸的積累也是以檸檬酸為主。干旱脅迫能加強(qiáng)黃果柑果實(shí)發(fā)育后期檸檬酸、蘋果酸和有機(jī)酸的降解程度，且干旱脅迫程度越大，果實(shí)中酸含量的降低越顯著，這與張規(guī)富[21]干旱脅迫對寬皮柑橘的影響結(jié)果一致，但鄧勝興[12]與肖明玉[15]在溫州蜜柑上的研究結(jié)果卻認(rèn)為，隨著干旱脅迫程度的增大，果實(shí)有機(jī)酸含量會發(fā)生顯著升高，這可能是由于柑橘品種間或不同栽培地柑橘樹體對干旱脅迫的適應(yīng)性不同所造成。進(jìn)一步研究表明，整個果實(shí)發(fā)育期，PEPC、MDH與線粒體ACO在不同程度干旱脅迫處理間均沒有表現(xiàn)出顯著差異，而果實(shí)發(fā)育后期，各處理間的細(xì)胞質(zhì)ACO與NAD-IDH活性差異表現(xiàn)出與各處理間有機(jī)酸降解程度所一致的規(guī)律。說明細(xì)胞質(zhì)ACO與NAD-IDH是造成不同程度干旱脅迫對黃果柑果實(shí)有機(jī)酸含量差異的主要酶，且干旱脅迫程度越高，2種酶的酶活性越高，從而有利于黃果柑果實(shí)有機(jī)酸的降解。曹淑燕等[19]在不同砧木對黃果柑果實(shí)有機(jī)酸代謝相關(guān)酶活性的影響研究也認(rèn)為，砧木間果實(shí)有機(jī)酸差異是ACO和NAD-IDH活性共同作用的結(jié)果，這與本研究的結(jié)果具有一致性。

4 結(jié) 論

輕度干旱脅迫在適度降低果實(shí)大小的前提下較大程度地提升果實(shí)中可溶性總糖及各糖組分含量，降低酸含量，有效提升了黃果柑的內(nèi)在品質(zhì)，而重度干旱脅迫雖然提升了果實(shí)蔗糖的含量，但限制了果實(shí)葡萄糖、果糖及可溶性總糖的積累，降低了黃果柑的整體品質(zhì)。糖代謝方面，SS合成方向是各脅迫處理間果實(shí)可溶性總糖含量出現(xiàn)差異的關(guān)鍵酶，而SPS和AI則是引起各脅迫處理間果實(shí)蔗糖含量出現(xiàn)差異的關(guān)鍵酶。酸代謝方面，黃果柑果實(shí)中細(xì)胞質(zhì)ACO與NAD-IDH是造成干旱脅迫下有機(jī)酸含量差異的關(guān)鍵酶，干旱脅迫能有效提升這2種酶的酶活性從而加劇黃果柑果實(shí)中有機(jī)酸的降解。