王 芬 羅欲承 游 琨

江蘇省興化市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 225700

葡萄球菌廣泛的存在自然界中，是皮膚及軟組織感染的主要病原菌，又因克林霉素在組織中較易滲透，所以臨床常用林可霉素及大環(huán)內(nèi)酯類治療葡萄球菌的感染[1]，由于臨床大量地使用這些藥物，從而使得林可霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率不斷升高，還時(shí)有誘導(dǎo)性克林霉素耐藥的情況發(fā)生，所以藥敏試驗(yàn)雖然體外敏感但卻往往療效甚微。日常藥敏試驗(yàn)又不能同時(shí)檢測(cè)克林霉素誘導(dǎo)性耐藥，所以實(shí)驗(yàn)室需另外進(jìn)行加做“D”試驗(yàn)以檢測(cè)是否存在誘導(dǎo)性克林霉素耐藥，但此方法耗時(shí)，故臨床亟須一種能縮短藥敏檢出時(shí)間的方法。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 從2018年1—12月本院住院病人的臨床檢出標(biāo)本中分離出81株克林霉素敏感(RS)、紅霉素耐藥的葡萄球菌(除去同一病人重復(fù)分離株)，菌株均經(jīng)VITEK-2 Compact系統(tǒng)鑒定到種，其中金黃色葡萄球菌(SA)檢出12株，標(biāo)本分別來(lái)自痰液、血液、傷口分泌物等；凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)檢出69株，其中表皮葡萄球菌25株，溶血葡萄球菌37株，其他種類的葡萄球菌7株。標(biāo)本來(lái)自血液65株，膿液3株，痰液1株。

1.2 儀器及試劑 鄭州安圖羊血瓊脂、MH 瓊脂、陽(yáng)性球菌鑒定卡(GP卡)、陽(yáng)性球菌藥敏卡(AST-GP67卡)，VITEK-2 Compact鑒定儀。克林霉素(DA)(2μg/片)紙片、紅霉素(E)(15μg/片)紙片購(gòu)自康泰生物科技有限公司。

1.3 質(zhì)控菌株 ATCC 29213：D試驗(yàn)陽(yáng)性株。

1.4 鑒定及藥敏試驗(yàn) 挑取培養(yǎng)好的分純菌落用0.45% NaCl稀釋液，調(diào)濁度為0.5～0.63McF，再吸取280μl加入另一0.45% Nacl溶液管中以備做藥敏。兩管分別放入GP鑒定卡片AST-GP67藥敏卡，放入VITEK-2 Compact鑒定儀中鑒定，儀器的藥敏系統(tǒng)設(shè)有高級(jí)專家系統(tǒng)，如有誘導(dǎo)耐藥則在主界面克林霉素一欄處修正為耐藥。耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)及甲氧西林敏感的葡萄球菌(MSS)均由VITEK-2 Compact鑒定儀進(jìn)行的頭孢西丁篩查試驗(yàn)所確定。

1.5 D試驗(yàn) 操作用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。將分純的菌株用無(wú)菌肉湯配成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?，用常?guī)的手工藥敏方法涂布于MH 瓊脂平板上，然后貼上克林霉素和紅霉素紙片輕輕按壓，兩紙片保持15mm的距離，35℃溫箱培養(yǎng)18h后讀取結(jié)果，相鄰紅霉素一側(cè)的克林霉素抑菌圈出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，形如“D”字為D試驗(yàn)陽(yáng)性，提示此株誘導(dǎo)耐藥陽(yáng)性，反之則為D試驗(yàn)陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用χ2檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法試驗(yàn)結(jié)果比較 81株RS葡萄球菌，D試驗(yàn)誘導(dǎo)率為55.6%(45/81)，VITEK-2 Compact儀器顯示誘導(dǎo)率為54.3%(44/81)，兩種檢測(cè)方法比較沒(méi)有顯著差異(χ2=0.012，P>0.05)，具有較高的一致性。見(jiàn)表1。

2.2 SA 、CNS 克林霉素誘導(dǎo)型耐藥結(jié)果比較 檢出的12株SA中有11株D試驗(yàn)陽(yáng)性，誘導(dǎo)率為91.7%(11/12)。CNS中有34株D試驗(yàn)陽(yáng)性，誘導(dǎo)率為49.3%(34/69)。二者誘導(dǎo)型耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 VITEK-2 Compact儀器法與D試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

表2 SA 、CNS 克林霉素誘導(dǎo)型耐藥結(jié)果比較

2.3 MRS、MSS克林霉素誘導(dǎo)型耐藥比較 檢出的63株MRS中有36株D試驗(yàn)陽(yáng)性，誘導(dǎo)率57.1%(36/63)。18株MSS中有9株D試驗(yàn)陽(yáng)性，誘導(dǎo)率50.0%(9/18)。二者誘導(dǎo)耐藥率比較差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 MRS、MSS克林霉素誘導(dǎo)型耐藥比較

3 討論

有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類耐藥機(jī)制有2種：一類是泵出機(jī)制，另一類是由于核糖體被甲基化后藥物作用的靶位改變，從而造成大環(huán)內(nèi)酯類及林可霉素類藥物耐藥[2-3]。它的耐藥性表現(xiàn)為持續(xù)性和誘導(dǎo)性耐藥[4]。 持續(xù)性耐藥表型表現(xiàn)為對(duì)紅霉素和林可霉素類藥物都耐藥，可用常規(guī)紙片擴(kuò)散法檢測(cè)，而誘導(dǎo)型耐藥用一般的方法檢測(cè)不出來(lái)。

2004年CLSI建議用標(biāo)準(zhǔn)的雙紙片法(即D試驗(yàn))來(lái)檢測(cè)是否有大環(huán)內(nèi)酯類誘導(dǎo)克林霉素耐藥的現(xiàn)象，來(lái)報(bào)告藥敏結(jié)果[5-6]。D試驗(yàn)操作相對(duì)容易、無(wú)須特殊儀器，其結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)基因分型法有很高的一致性[7]，這種檢測(cè)耐藥表型的傳統(tǒng)紙片擴(kuò)散法，雖然易操作，但也有很多影響因素比如菌液濃度、紙片之間的間隔距離等，尤其是紅霉素與克林霉素紙片之間距離的影響，有報(bào)道稱檢測(cè)時(shí)紙片間隔15mm的距離準(zhǔn)確性較高，距離大可出現(xiàn)誘導(dǎo)表型漏檢[8-9]。若兩紙片間距過(guò)大可導(dǎo)致假陰性[10]，因此試驗(yàn)時(shí)很難把握細(xì)微的距離差別。而VITEK-2 Compact儀器法無(wú)須考慮這些人為因素對(duì)準(zhǔn)確性的影響，只要調(diào)好儀器要求的菌液濁度范圍即可上機(jī)操作，簡(jiǎn)便易行。

本文中81株克林霉素敏感紅霉素耐藥葡萄球菌中有45株表現(xiàn)為誘導(dǎo)克林霉素耐藥，占55.6%(45/81)，顯示了很高的水平，與有關(guān)研究的結(jié)果相似[11]，提示對(duì)葡萄球菌進(jìn)行克林霉素耐藥誘導(dǎo)檢測(cè)具有重要的臨床價(jià)值。

通過(guò)比對(duì)試驗(yàn)兩種方法檢測(cè)的誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明VITEK-2 Compact系統(tǒng)檢測(cè)葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥與D試驗(yàn)具有很好的一致性。建議在常規(guī)工作中用VITEK-2 Compact儀器法代替紙片擴(kuò)散法檢測(cè)，使該檢測(cè)結(jié)果可以與常規(guī)藥敏一同檢出。縮短檢測(cè)時(shí)間，及時(shí)為臨床提供藥敏結(jié)果。

本文通過(guò)對(duì)葡萄球菌屬克林霉素誘導(dǎo)耐藥結(jié)果的分析顯示，RS菌株中金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型耐藥率(91.7%)高于凝固酶陰性的葡萄球菌(49.3%)，這與有關(guān)報(bào)道相似[12]，臨床上金黃色葡萄球菌是引起傷口、軟組織等化膿性感染的主要病原菌[13]。而CNS一般為皮膚表面寄生菌，多為條件致病菌，當(dāng)人體免疫力低下時(shí)易感，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的血藥濃度分布有一定的特點(diǎn)，在組織中濃度高易滲透，故臨床上常選其作為治療金葡菌感染的主要藥物，這可能是導(dǎo)致克林霉素誘導(dǎo)型耐藥率增高的原因。另外比較MRS與MSS二者克林霉素誘導(dǎo)耐藥率的產(chǎn)生無(wú)明顯差異，這說(shuō)明甲氧西林耐藥并不影響葡萄球菌誘導(dǎo)型耐藥的產(chǎn)生。

綜上所述，本文通過(guò)對(duì)VTEK-2 Compact全自動(dòng)儀器法和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)葡萄球菌中克林霉素誘導(dǎo)性耐藥的比較和分析，表明VTEK-2 Compact全自動(dòng)分析系統(tǒng)能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出克林霉素誘導(dǎo)性耐藥，大大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，本法簡(jiǎn)便易行，在常規(guī)標(biāo)本檢測(cè)藥敏的同時(shí)就能直接看到克林霉素誘導(dǎo)性耐藥的結(jié)果，平均時(shí)間6h，不需附加另外試驗(yàn)，精簡(jiǎn)了檢驗(yàn)流程，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間。為臨床提供了合理使用抗生素的依據(jù)。