棕櫚酸誘導BRL-3A細胞產生胰島素抵抗的作用機制*

崔敏萱，沈歆，蓋守昌，井娟，王力彬，張生勇，劉雪英

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學1.基礎醫(yī)學院四大隊；2.藥學系藥物化學教研室，西安 710032)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病發(fā)展進程中首先出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)。長期IR會誘發(fā)一系列代謝性疾病，如肥胖、糖調節(jié)損傷、2型糖尿病、脂肪肝、脂代謝紊亂等[1]。肝臟是胰島素作用的主要靶器官，能夠儲存大量肝糖原，通過糖異生途徑將乳酸等代謝產物轉變?yōu)槠咸烟?，維持機體血糖穩(wěn)定。研究表明，2型糖尿病患者的肝臟糖異生水平較正常人明顯升高，因此肝臟糖異生是糖尿病治療中不可忽視的重要環(huán)節(jié)[2]。

建立IR肝細胞模型有助于深入研究IR發(fā)生機制，篩選抗IR藥物。目前已成熟應用的、最常見的肝細胞模型是高胰島素誘導HepG2肝癌細胞IR模型[3]。大鼠正常肝細胞IR模型較少見，目前國內僅有少量文獻報道，筆者尚未見國外文獻關于系統(tǒng)建立大鼠正常肝細胞IR模型及機制研究的報道，所以篩選出誘導正常肝細胞IR模型的條件有重要意義。

脂肪酸是構成人體脂肪和類脂的基本物質，大量流行病學研究表明，肥胖者血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平普遍升高。高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)IR的重要致病因素[4]。高濃度FFA能夠抑制基礎狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)的組織對葡萄糖的攝取與利用，造成組織對胰島素的敏感性降低。利用FFA的這種特性，可以將其作為誘導不同類型細胞產生IR的工具。油酸、硬脂酸和棕櫚酸是血液中FFA常見的3種類型，均屬飽和長鏈脂肪酸。研究報道，利用棕櫚酸可以建立HepG2和3T3-L1細胞的IR模型[3，5]。

BRL-3A是大鼠正常肝細胞系，是研究正常肝細胞增殖及氧化損傷常用細胞模型。胰島素受體底物1(insulin receptor substance 1，IRS-1)與胰島素受體作用后，參與胰島素及其信號通路傳導，是胰島素信號通路上游的一個重要分子。IRS-1被抑制后，進一步抑制磷脂酰肌醇-3'-羥基激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)途徑，使葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)被抑制，從而使組織不能有效利用葡萄糖，發(fā)生IR[6]。本實驗以BRL-3A細胞為研究對象，通過棕櫚酸誘導系統(tǒng)建立大鼠正常肝細胞IR模型，并初步探索其發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1主要儀器Western blotting系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；酶標儀(Molecular Devices，美國)；高速低溫離心機(Eppendorf，美國)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron，美國)；YI-875SA醫(yī)用超凈工作臺(江蘇吳江市凈化設備總廠)。

1.2試藥與試劑棕櫚酸(美國Sigma公司，批號：1001002747，含量≥99%)；胰島素(美國Sigma公司，批號：18883664，含量≥99%)，MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：AD21573269)；胎牛血清(美國Hyclone公司，批號：P140022)；牛血清清蛋白(albumin from bovine serum，BSA，美國Sigma公司，批號：CO0332，含量≥98%)；CCK8檢測盒(七海生物科技有限公司)；葡萄糖檢測盒(南京建成生物工程研究所)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：P00125)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：P0012A)；IRS-1、PI3K、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphorylated serine-threonine kinase，p-AKT)、AKT、GLUT4抗體(美國Abcam公司，批號分別為：GR95405-23，GR266942-1，GR242901-23，GR242901-21，GR262376-1)。

1.3細胞BRL-3A大鼠正常肝細胞(陜西帆昌生物科技公司)。

1.4棕櫚酸、胰島素儲備液配置取棕櫚酸25.6 mg[7]溶于無水乙醇1 mL中，制成100 mmol·L-1棕櫚酸溶液，溶解時加熱至50 ℃，取0.25 mL 加入預熱55 ℃的10% BSA溶液4.75 mL 溶解，得到終濃度為5 mmol·L-1的棕櫚酸母液。經孔徑0.2 μm水相濾膜濾過后，-20 ℃保存，實驗前37 ℃預熱后按比例稀釋。取胰島素固體2.904 mg溶于5 mL、pH值2～3的鹽酸(HCl)中，制成1×10-4mol·L-1胰島素母液。經孔徑0.2 μm水相濾膜濾過后，-20 ℃保存，實驗前按比例稀釋。

1.5BRL-3A細胞培養(yǎng) BRL-3A細胞復蘇后，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100 kU·L-1青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，在5%二氧化碳(CO2)、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待匯合度達90%后，1：2傳代，或按每孔約1×104個接種于96孔培養(yǎng)板，匯合度超過80%后分組實驗。

1.6棕櫚酸、胰島素對BRL-3A細胞增殖的影響(CCK8實驗) 將細胞以每孔約1×104個接種于96孔培養(yǎng)板中。按“1.5”項方法培養(yǎng)至匯合度超過80%后。然后分成正常對照組、棕櫚酸組(0.025，0.05，0.1，0.2，0.25，0.4，0.6 mmol·L-1棕櫚酸)、胰島素組(1×10-7mol·L-1胰島素)及空白試劑組(5×10-7mol·L-1HCl、0.6%乙醇)，每組設置8組復孔。采用CCK8法分別測定6，12，24，36 h時細胞的生長狀況。CCK8檢測：終止培養(yǎng)后，加入含CCK8的新培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，充分反應。反應結束后，檢測波長450 nm處各孔的吸光度值。

1.7不同時間不同濃度棕櫚酸、胰島素對BRL-3A細胞葡萄糖代謝的影響 實驗分組：正常對照組、棕櫚酸組(0.025，0.05，0.1，0.2，0.25，0.4 mmol·L-1棕櫚酸)，每組設置12組復孔。按“1.5”項方法將細胞接種于96孔板，待匯合度超過80%后，按實驗分組加入含不同誘導因素的MEM培養(yǎng)基。通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法[8]，分別測定2，6，12，24 h時培養(yǎng)液中含有葡萄糖的濃度，即可通過計算得到各組細胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖氧化酶-過氧化物酶檢測：終止培養(yǎng)后，吸出所有培養(yǎng)液并按說明書操作加入工作液，混勻后37 ℃，保溫15 min，用酶標儀測定波長在505 nm各孔的吸光度值。

1.8不同時間不同濃度棕櫚酸誘導后BRL-3A細胞對基礎糖轉運和胰島素刺激糖轉運的影響 在檢測“1.7”項各組培養(yǎng)液中所剩糖濃度后，吸出原培養(yǎng)液，每組一分為二，即每組6個復孔：一半加入含1×10-7mol·L-1胰島素的MEM培養(yǎng)基，另一半加入空白的MEM，分別測2，24，48，72 h后培養(yǎng)液中所剩葡萄糖濃度。葡萄糖含量測定同“1.7”項實驗。

1.9免疫印跡法檢測棕櫚酸誘導BRL-3A細胞產生IR后IRS-1等靶蛋白表達的變化 實驗分組：正常對照組、IR組。按“1.5”項方法培養(yǎng)至匯合度超過90%后，正常對照組加入空白的MEM培養(yǎng)基，IR組加入含0.2 mmol·L-1棕櫚酸的MEM培養(yǎng)基，作用12 h后，采用免疫印跡法，將各組細胞用預冷的組織裂解液裂解并用超聲儀打碎，然后在4 ℃以12 000×g離心15 min，取上清液作樣本，用BCA蛋白定量法測定各樣本蛋白含量。用10%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后用半干電轉的方法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯[poly(vinylidene fluoride)，PVDF]膜上，再用5%脫脂奶粉封閉，室溫下封閉1 h后加入一抗4 ℃封閉過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖封閉1 h。PBST充分洗膜后，加入適量電化學發(fā)光液涂勻，凝膠成像分析系統(tǒng)顯影、攝像、分析。

2 結果

2.1BRL-3A細胞的培養(yǎng)結果 BRL-3A細胞復蘇后形成細胞懸液，吹勻后按要求種于96孔板或者培養(yǎng)瓶中，6～10 h形成單層貼壁細胞，鏡下觀察細胞貼壁生長，不規(guī)則排列，形態(tài)多為梭形、三角形或者多邊形，呈上皮樣外觀。

2.2棕櫚酸、胰島素對BRL-3A細胞增殖的影響 空白試劑組(5×10-7mol·L-1HCl、0.6%乙醇)每個時間點的吸光度值與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明空白試劑對細胞活性無干擾。結果見圖1。0.025～0.2 mmol·L-1棕櫚酸及1×10-7mol·L-1胰島素作用于BRL-3A細胞36 h以內，其吸光度值與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明其對細胞增殖沒有抑制作用。0.25 mmol·L-1棕櫚酸作用于細胞時，從24 h開始吸光度值與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，0.4和0.6 mmol·L-1棕櫚酸從6 h開始其吸光度值與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，顯示其對BRL-3A細胞增殖產生抑制作用。結果見圖2。

A.正常對照組；B.空白試劑組(5×10-7 mol·L-1 HCl)；C.空白試劑組(0.6%乙醇)。

A.正常對照組；B.0.6 mmol·L-1棕櫚酸組；C.0.4 mmol·L-1棕櫚酸組；D.0.25 mmol·L-1棕櫚酸組；E.0.2 mmol·L-1棕櫚酸組；F.0.1 mmol·L-1棕櫚酸組；G.0.05 mmol·L-1棕櫚酸組；H.0.025 mmol·L-1棕櫚酸組；I.1×10-7 mol·L-1胰島素組。①與正常對照組比較，t=3.061～59.900，P<0.01；②與正常對照組比較，t=2.592，18.860，P<0.05。

2.3不同時間不同濃度棕櫚酸對BRL-3A細胞葡萄糖代謝的影響 BRL-3A細胞用不同濃度棕櫚酸培養(yǎng)2 h后，0.4 mmol·L-1棕櫚酸組葡萄糖消耗量較正常對照組低(P<0.01)，表明高濃度棕櫚酸作用2 h后BRL-3A細胞已開始出現(xiàn)IR；6 h后，0.25，0.2 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量開始降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h后，0.4，0.25，0.2 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量與正常對照組比較明顯降低(P<0.01)，表明3種濃度作用12 h后均出現(xiàn)顯著IR表征；24 h后，0.4，0.25，0.2及0.1 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量均較正常對照組低(P<0.01，P<0.05)。結果見圖3。

A.正常對照組；B.0.4 mmol·L-1棕櫚酸組；C.0.25 mmol·L-1棕櫚酸組；D.0.2 mmol·L-1棕櫚酸組；E.0.1 mmol·L-1棕櫚酸組；F.0.05 mmol·L-1棕櫚酸組；G.0.025 mmol·L-1棕櫚酸組。①與正常對照組比較，t=4.262～31.400，P<0.01；②與正常對照組比較，t=2.185～2.685，P<0.05。

2.4不同時間不同濃度棕櫚酸誘導后BRL-3A細胞對基礎糖消耗和胰島素刺激糖消耗的影響 0.25，0.2 mmol·L-1棕櫚酸誘導BRL-3A細胞12，24 h和0.1 mmol·L-1棕櫚酸誘導BRL-3A細胞24 h后，加胰島素刺激的糖轉運和不加胰島素刺激的基礎糖轉運與正常對照組比較，2，12，24 h時培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度均較高，說明其對胰島素刺激的糖轉運和基礎糖轉運均產生抑制，且抑制作用可持續(xù)24 h。并且0.25和0.2 mmol·L-1棕櫚酸加胰島素刺激的糖轉運組培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度減少的程度呈現(xiàn)時間累加效應。0.4 mmol·L-1棕櫚酸誘導BRL-3A細胞6 h后，加胰島素刺激的糖轉運和不加胰島素刺激的基礎糖轉運與正常對照組比較，2，12，24 h時培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度均較高，說明其作用6 h即能對胰島素刺激的糖轉運和基礎糖轉運產生抑制作用。結合“2.2”項實驗結果，表明0.4 mmol·L-1棕櫚酸作用6 h和0.25 mmol·L-1棕櫚酸作用24 h后對BRL-3A細胞產生毒性作用。另外，BRL-3A細胞IR模型與棕櫚酸作用的時間和濃度有一定的劑量-時間效應關系。結果見表1，2。

表1 不同時間不同濃度棕櫚酸誘導BRL-3A細胞后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

2.5棕櫚酸誘導的BRL-3A細胞IR模型穩(wěn)定性評估

2.5.1IR模型BRL-3A細胞長期基礎葡萄糖消耗變化 通過上述“2.3”“2.4”項葡萄糖消耗實驗，以及“2.2”項細胞增殖實驗，初步確定使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導BRL-3A細胞IR模型的條件。使用該條件誘導BRL-3A細胞IR后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，發(fā)現(xiàn)其基礎葡萄糖消耗量較正常對照組低(t2 h=2.842，P<0.05；t12 h=11.280，t24 h=17.430，t48 h=35.750，P<0.01)，且隨著培養(yǎng)時間增加，細胞葡萄糖消耗量與正常對照組比較減少量逐漸增加，表明該IR模型在48 h內較穩(wěn)定。結果見圖4。

①與正常對照組比較，P<0.05；②與正常對照組比較，P<0.01。

表2 不同時間不同濃度棕櫚酸和胰島素刺激BRL-3A細胞后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

2.5.2胰島素抵抗BRL-3A細胞長期胰島素刺激的葡萄糖消耗變化 同“2.5.1”項實驗，使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導BRL-3A細胞IR模型的條件。使用該條件誘導BRL-3A細胞產生IR后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，同樣發(fā)現(xiàn)其胰島素刺激的葡萄糖消耗量與正常對照組比較明顯降低(t2 h=6.336，t12 h=12.090，t24 h=19.550，t48 h=27.550，P<0.01)，且隨著培養(yǎng)時間增加，細胞葡萄糖消耗量與正常對照組比較減少量逐漸增加，表明該IR模型在48 h內較穩(wěn)定。結果見圖5。

①與正常對照組比較，P<0.01。

2.6免疫印跡法檢測棕櫚酸誘導BRL-3A細胞產生IR后IRS-1等靶蛋白表達的變化 同“2.5”項實驗，使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導BRL-3A細胞IR模型的條件，觀察胰島素相關蛋白表達變化。與正常對照組比較，IR組細胞IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表達均明顯下降(t=10.950，6.307，6.728，8.045，P<0.05)。結果見圖6。

A.正常對照組；B.IR組。①與正常對照組比較，P<0.05。

3 討論

IR是指機體靶器官、靶組織對胰島素反應的敏感性下降，從而導致生理濃度的胰島素不能將機體血糖維持在正常水平。IR是2型糖尿病的重要致病因子，也是其最主要的病理表現(xiàn)。目前，IR的致病機制并不完全清楚。建立適宜的IR細胞模型有助于在細胞及分子水平深入研究其發(fā)生機制，也為體外篩選防治IR的藥物提供便利條件。肝臟是胰島素作用的重要靶器官，能夠維持體內糖脂代謝平衡，并與肝臟IR、IR綜合征及脂肪肝等病癥密切相關[9]。目前使用的肝細胞IR模型多為HepG2肝癌細胞，正常肝細胞模型較少被提及。

胰島素能夠通過PI3K/AKT信號通路維持機體血糖穩(wěn)態(tài)。胰島素首先與細胞膜外的胰島素受體結合，使胰島素受體發(fā)生構象變化，其細胞膜內的酪氨酸位點發(fā)生自磷酸化，進一步吸引IRS和胰島素受體結合，導致自身酪氨酸位點磷酸化。磷酸化的胰島素受體底物會進一步與PI3K的調節(jié)亞基結合，激活PI3K下游小分子如PIP3，PIP3與AKT結合，促進AKT被磷酸化，增加活性。從而激活GLUT4，促進葡萄糖吸收，增加葡萄糖消耗[10]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可以成功誘導BRL-3A細胞胰島素模型，0.4 mmol·L-1棕櫚酸作用6 h、0.25 mmol·L-1棕櫚酸和0.2 mmol·L-1PA作用12 h以及0.1 mmol·L-1PA作用24 h均能成功誘導BRL-3A細胞產生IR。0.4 mmol·L-1棕櫚酸處理6，12，24 h，0.25 mmol·L-1棕櫚酸和0.2 mmol·L-1處理12，24 h后均可抑制胰島素刺激的糖轉運和無胰島素刺激的基礎糖轉運，說明此誘導模型已經產生IR，這種抑制作用呈劑量-時間依賴性。并且通過移除棕櫚酸刺激后長期培養(yǎng)該細胞，發(fā)現(xiàn)抑制作用可以持續(xù)48 h。0.4和0.25 mmol·L-1棕櫚酸均可成功誘導BRL-3A細胞產生IR，但同時對BRL-3A細胞增殖產生影響，分別從6 h和24 h開始出現(xiàn)毒性作用。而低濃度的棕櫚酸(0.2 mmol·L-1)作用12 h后也能誘導BRL-3A細胞產生IR，同時能夠抑制胰島素刺激的糖轉運和不加胰島素刺激的基礎糖轉運，并且在36 h內對BRL-3A細胞增殖無影響。

綜上所述，0.2 mmol·L-1棕櫚酸處理12 h可作為誘導BRL-3A細胞IR模型的方法。在成功誘導的BRL-3A細胞IR模型中，IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表達均明顯下降，提示棕櫚酸可能通過抑制IRS-1表達，導致PI3K/AKT通路被抑制，進一步下調GLUT4表達，使糖代謝受阻，導致IR。本研究成功建立了BRL-3A細胞IR模型，并初步在蛋白水平闡述了棕櫚酸可能的作用機制，為進一步探究大鼠正常肝細胞產生IR及相關藥物體外篩選提供參考依據(jù)。