劉月，楊文健，孫曉東，桑明，焦蓉

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院兒科，襄陽 441000)

膿毒癥是一種由感染引起的失控的全身性炎癥反應(yīng)，具有發(fā)病率高、死亡率高等特點，是重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因之一[1-2]。約50%膿毒癥患者會出現(xiàn)不同程度的心肌損傷[3-4]，死亡率高達(dá)70%[1]。膿毒癥心功能障礙的致病因素有多種，其中炎癥反應(yīng)、凋亡和氧化損傷在心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[4]。目前臨床上針對膿毒癥心功能損傷的治療措施以改善循環(huán)、營養(yǎng)等對癥支持治療為主，仍缺乏特異性治療方法[4]。因此迫切需要尋找新的治療膿毒癥心肌損傷的藥物。青藤堿(sinomenine)是一種嗎啡烷類生物堿，主要來源于防己科植物青風(fēng)藤的根和莖，具有廣泛的藥理作用，如顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、抗氧化和抗炎作用[5-7]。青藤堿藥用形式多為鹽酸鹽，臨床上廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、癌癥和系膜增生性腎炎等疾病，并且沒有明顯的不良反應(yīng)[5，8-10]。研究證實，青藤堿可通過抑制損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)誘導(dǎo)的“炎癥風(fēng)暴”來改善脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷，發(fā)揮重要的抗內(nèi)毒素和抗炎效應(yīng)[11]。但是，青藤堿對于脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷研究較少。本實驗以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為研究載體，以脂多糖刺激，比較不同濃度的青藤堿或作用不同時間對心肌細(xì)胞的影響，探討青藤堿對脂多糖誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株H9c2大鼠心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海)，用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的高糖達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中，飽和濕度下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)液顏色變化和細(xì)胞生長狀態(tài)，及時換液，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

1.2藥品與試劑青藤堿(Aladdin公司，批號：S101688，含量≥97%)；脂多糖(美國Sigma公司，批號：L4391，血清型0111：B4)；高糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco，批號：8118110)；胎牛血清(四季青公司，批號：20170315)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、青鏈霉素雙抗(Gibco，批號：25200056，15240062)；Trizol(MRC公司，批號：TR118)；CCK-8試劑盒(Biosharp公司，批號：BS350A)；兔抗鼠Bax抗體(批號：14796)、兔抗鼠Bcl-2抗體(批號：2764)、兔抗鼠caspase-3抗體(批號：9664)、兔抗鼠caspase-9抗體(批號：9508S)、兔抗鼠絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抗體(批號：9154，9126)、兔抗鼠細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)抗體(批號：4370，4695)和兔抗鼠GAPDH抗體(批號：5174)均來自Cell Signaling Technology公司。

1.3細(xì)胞處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞分為正常對照組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，給予無血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，再更換為完全培養(yǎng)基；脂多糖組：細(xì)胞加藥前饑餓處理12 h，加入10 μg·mL-1脂多糖，孵育4，8 或12 h；青藤堿組：細(xì)胞饑餓處理12 h后分別加入25，50，100 μmol·L-1青藤堿作用30 min，再予以10 μg·mL-1脂多糖孵育4，8或12 h。

1.4細(xì)胞活性測定使用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期H9c2細(xì)胞，按每孔8000個細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞生長至每孔面積的85%后，更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，饑餓處理12 h后，向各孔內(nèi)加入25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤堿，重復(fù)5個孔，每孔100 μL。同時，部分孔加入完全培養(yǎng)基100 μL作為正常對照組。12 h后，向各孔中加入CCK-8溶液10 μL，并繼續(xù)孵育，4 h后使用酶標(biāo)儀檢測540 nm處各孔的吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A給藥組-A空白)/(A對照組-A空白)×100%。

1.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定向12孔板各孔中加入 Trizol試劑300 μL，反復(fù)吹打后收集上清液，提取各組細(xì)胞RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和oligo dT將每組 RNA樣品2 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書要求，采用SYBR Green在7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-PCR。GAPDH用作參照基因。使用2-△△CT計算腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的相對mRNA水平。引物序列如下：TNF-α上游：5′-AGCATGATCC GAGATGTGGAA-3′，下游：5′-TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3′；IL-1β上游：5′-GGGATGATGACGACCTGCTAG-3′，下游：5′-ACCACTT-GTTGGCTTATGTTCTG-3′；IL-6上游：5′-GTTGCCTT CTTGGGACTGATG-3′，下游：5′-ATACTGGTCTGTTGT-GGGTGG T-3′；MCP-1上游：5′-AGTCGGCTGGAGAA-CTACAAGA-3′，下游：5′-CTGAAGTCCTTAGGGTTGAT-GC-3′；GAPDH上游：5′-GACATG CCGCCTGGAGAAAC-3′，下游：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。

1.6免疫印跡(Westernblotting)測定提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)：在6孔板內(nèi)各加蛋白裂解液500 μL，冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r·min-1離心10 min后獲得蛋白上清液。使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒測定各組蛋白質(zhì)濃度。每組樣本混勻后取40 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯[poly(vinylidene fluoride)，PVDF]膜(Millipore，Billerica，MA，美國)。由TBST配置的5%脫脂奶粉封閉PVDF膜90 min，再用一抗封閉液孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌5次后，二抗室溫下再孵育1 h，后用TBST清洗5次。配制電化學(xué)發(fā)光顯色液，在暗房中顯影。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用T-test和方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1青藤堿對細(xì)胞活力影響青藤堿和(或)脂多糖作用H9c2心肌細(xì)胞12 h后檢測各組細(xì)胞的活力(n=5)，正常對照組細(xì)胞活性為100%，而25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤堿處理12 h后各組細(xì)胞活力依次為97.0%，96.5%，94%，93.5%，92.0%，較正常對照組存活率稍有下降，但均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。濃度<200 μmol·L-1的青藤堿對細(xì)胞活力的影響較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可排除青藤堿對細(xì)胞活性的影響，不干擾本實驗結(jié)果。

2.2青藤堿對H9c2心肌細(xì)胞炎癥因子的影響 脂多糖組H9c2細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 mRNA水平均顯著高于正常對照組，青藤堿組炎癥因子的mRNA水平顯著下降，其中100 μmol·L-1青藤堿作用最為顯著(P<0.01)。脂多糖作用心肌細(xì)胞4 h后，TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平即明顯升高，并且在12 h內(nèi)達(dá)最高水平，而青藤堿組在12 h內(nèi)IL-6、IL-1β和MCP-1基因水平均顯著低于脂多糖組，見圖1。青藤堿呈劑量和時間依賴性抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌炎癥因子的基因水平。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿25 μmol·L-1組；D.青藤堿50 μmol·L-1組；E.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=6.80～19.69，P<0.01；②與脂多糖組比較，t=6.80～30.80，P<0.05；③與脂多糖組比較，t=14.50～38.40，P<0.01。

2.3青藤堿對細(xì)胞凋亡的影響見圖2。與正常對照組比較，脂多糖不同程度地促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)量明顯升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降；與脂多糖組比較，青藤堿組caspase-3和caspase-9表達(dá)量顯著下降，Bcl-2/Bax比值明顯升高。其中，與作用0.5 h比較，青藤堿對caspase-3和caspase-9的抑制作用在2 h時效果更為顯著。較青藤堿25 μmol·L-1組，青藤堿100 μmol·L-1組H9c2細(xì)胞Bcl-2/Bax比值顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡顯著改善。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿25 μmol·L-1組；D.青藤堿50 μmol·L-1組；E.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=5.00～22.05，P<0.01；②與脂多糖組比較，t=10.90～11.85，P<0.01；③與脂多糖組比較，t=7.20，P<0.05。

2.4青藤堿對MEK/ERK1/2通路的影響 見圖3。脂多糖組p-ERK和p-MEK表達(dá)量與正常對照組比較顯著升高，并且脂多糖作用2 h后p-ERK和p-MEK表達(dá)量顯著高于脂多糖作用0.5 h組，說明脂多糖呈時間依賴性地升高p-ERK和p-MEK蛋白水平。青藤堿組蛋白表達(dá)量較脂多糖組顯著下降，并且青藤堿處理2 h內(nèi)磷酸化的ERK和MEK表達(dá)量均低于脂多糖組。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=10.00，41.00，P<0.05；② 與正常對照組比較，t=22.00～71.00，P<0.01；③與脂多糖組比較，t=10.29，18.58，P<0.05；④與脂多糖組比較，t=22.47，24.60，P<0.01。

3 討論

心功能障礙是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。心功能障礙的發(fā)生伴隨著過度的炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙和凋亡。脂多糖是公認(rèn)的一種致病因子，可誘發(fā)膿毒癥[12]。本研究采用10 μg·mL-1脂多糖刺激H9c2建立心肌損傷模型，脂多糖處理H9c2以后，細(xì)胞促炎因子水平顯著升高，細(xì)胞凋亡增多，提示模型制備成功[13]。

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可顯著抑制炎癥反應(yīng)，作用機(jī)制為：抑制損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的“炎癥風(fēng)暴”來改善脂多糖誘導(dǎo)炎癥損傷[14]；抑制P38絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[5]。Caspase-3是caspase信號通路中凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。青藤堿可調(diào)控caspase的活化以誘導(dǎo)各種細(xì)胞凋亡[15]。青藤堿在不同的疾病中對凋亡的作用不同，如在腫瘤的病程中，青藤堿促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌癥病程[16-17]；在非惡性腫瘤的病程中，青藤堿抑制功能細(xì)胞凋亡，減輕組織損傷[15，18-19]。

脂多糖作用后，炎癥因子過度表達(dá)，心肌細(xì)胞凋亡壞死，青藤堿則顯著降低細(xì)胞促炎癥因子水平，并下調(diào)caspase-3和caspase-9，抑制細(xì)胞凋亡，部分阻斷MEK/ERK的活化。MEK/ERK作為絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員，調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和分化。脂多糖與TLR4結(jié)合激活下游信號通路，激活MEK/ERK，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]，提示青藤堿可能通過抑制MEK/ERK的活化來抑制凋亡，改善心肌細(xì)胞損傷。此外，青藤堿也可通過Nrf2-keap1-PKC通路改善膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激損傷[22]；通過煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)抑制巨噬細(xì)胞中CD14/TLR4的表達(dá)，激活JAK2/STAT3通路，抑制機(jī)體TNF-α、MCP-1、MIF和MMP-9的表達(dá)水平，改善炎癥損傷[23]。

本研究的局限性為沒有進(jìn)行動物實驗，沒有直觀觀察青藤堿對膿毒癥大鼠心功能和生存率的影響。其次，應(yīng)用H9c2細(xì)胞進(jìn)行實驗，而非大鼠原代心肌細(xì)胞，這兩種細(xì)胞在生理特性上仍存在差異。但是，本研究不僅探究了青藤堿的抗炎效果，還探究了不同作用時間及濃度對心肌細(xì)胞的作用，為膿毒癥心功能障礙的治療提供新的治療方向。