沙棘熊果酸對(duì)酒精性肝病模型大鼠的保護(hù)作用*

李可欣，張男男，侯瑞麗，張文龍，高龍，苗曉涵，戈娜

(1.包頭醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品健康研究所，包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，包頭 014010)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是指長(zhǎng)期和(或)大量酒精攝入所導(dǎo)致的肝臟損傷，肝細(xì)胞凋亡、脂肪變性、炎癥、壞死等是它的主要表現(xiàn)形式[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)在2018年《全球酒精與健康報(bào)告》中指出，全世界每年因飲酒而死亡的人數(shù)占全部死亡人數(shù)的5.3%，約300萬人，其中2013年北京302醫(yī)院接診的ALD患者人數(shù)是2002年的2倍[3]。因此積極尋找一種預(yù)防及輔助治療ALD的天然活性物質(zhì)具有重要意義。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)蒙名其察日嘎納，含多種生物活性成分，是珍貴的藥食兩用植物[4]。本課題組前期從沙棘中提取的熊果酸是一種天然植物化合物，近年來已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品中[5]。熊果酸具有保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以沙棘熊果酸為研究對(duì)象，通過酒精誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型，探討沙棘熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)性肝損傷的改善效果及可能的作用機(jī)制，為酒精誘導(dǎo)肝損傷的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1材料沙棘果由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)于呼和浩特市和林縣境內(nèi)野生沙棘林采集、提供，經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王玉珍教授鑒定(Shaji-2012-1215)，分離純化由內(nèi)蒙古科技大學(xué)進(jìn)行，并應(yīng)用紅外光譜、氫核磁共振譜(1H-NMR)和碳核磁共振譜(13C-NMR)鑒定為五環(huán)三萜類化合物[7]。熊果酸分子式為C30H48O3，相對(duì)分子質(zhì)量為456.68，含量93.8%。

1.2主要試劑和儀器無水乙醇購自西隴科學(xué)股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自Roche公司(批號(hào)：11684817910)；鼠抗GAPDH多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司(批號(hào)：sc-47724)；BCA蛋白濃度試劑盒(批號(hào)：P0012)、超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：P0018FS)、RIPA裂解液(批號(hào)：P0013B)、苯甲基磺酰氟(批號(hào)：ST506)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(批號(hào)：P0015)均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；羊抗兔Bcl-2(批號(hào)：MABC573)、Bax(批號(hào)：AB2915)、cleaved caspase-3(批號(hào)：ABC495)多克隆抗體購自美國(guó)Millipore公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號(hào)：ZB-2301)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(批號(hào)：ZB-2305)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

RM2135型石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；CX41照相顯微鏡(日本Olympus公司)；BAYGENE電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；550型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；UVP-GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(190±10)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0001。大鼠于室溫(23±2)℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h光照循環(huán)的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

將適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后的大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)分組，分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和熊果酸小、中、大劑量組，共5組，每組10只。給藥方式參考馬浩然等[2]報(bào)道的方法，即模型對(duì)照組參考給予50%(V/V)乙醇8 mL·kg-1·d-1×2周+12 mL·kg-1·d-1×6周；正常對(duì)照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液；熊果酸小、中、大劑量組分別給予熊果酸50，100，150 mg·kg-1·d-1，1 h后給予和模型對(duì)照組等體積乙醇。持續(xù)灌胃8周，最后一次灌胃后禁食不禁水12 h，將大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉。腹主動(dòng)脈取血，將血清以3000 r·min-1離心15 min(r=15 cm)；留取肝組織，將部分肝組織進(jìn)行固定，其余組織均置于-80 ℃冰箱中凍存。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察每組大鼠肝組織病理情況將0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm新鮮肝大葉組織放置于10%甲醛中固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.4.2沙棘熊果酸對(duì)各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及肝組織TG含量的影響各組大鼠ALT和AST水平檢測(cè)嚴(yán)格按照ALT/AST測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)量505 nm處吸光度(A值)并計(jì)算ALT和AST的含量。

取新鮮肝組織1 g，經(jīng)過漂洗，拭干，剪碎后，加入適量磁珠及0.9%氯化鈉溶液900 μL勻漿5 min，經(jīng)3000 r·min-1離心15 min(r=15 cm)后取上清液，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照TG說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)量500 nm處A值，樣本含量與A值成正比，以mmol·g-1表示。

1.4.3TUNEL染色法檢測(cè)各組大鼠肝細(xì)胞的凋亡情況取新鮮肝臟組織做石蠟切片，嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行操作，光鏡下(×200)觀察，以凋亡細(xì)胞核內(nèi)為黃色或棕黃色顆粒沉淀物為判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算肝細(xì)胞總數(shù)、凋亡肝細(xì)胞數(shù)、肝細(xì)胞凋亡率，分析大鼠肝細(xì)胞凋亡情況。

1.4.4免疫印跡法(Western blotting)測(cè)定每組大鼠肝組織Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)量 裂解大鼠肝組織提取總蛋白，12 000 ×g離心20 min，并收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按5份樣品體積與1份loading buffer混勻，100 ℃孵育3 min，上樣體積為10～20 μL，經(jīng)5%～12% SDS-PAGE分離樣品后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作加入相應(yīng)的一抗(GAPDH抗體1：800、Bcl-2抗體1：1000、Bax抗體1：1000、cleaved caspase-3抗體1：1000)及適當(dāng)稀釋倍數(shù)的二抗。凝膠成像系統(tǒng)攝相分析。以GAPDH作為內(nèi)參，用靶蛋白積分吸光度(IA)值/GAPDH(IA)值顯示靶蛋白相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1沙棘熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞輪廓完整且結(jié)構(gòu)緊密、以中央靜脈為中心向四周呈放射狀分布；模型對(duì)照組肝細(xì)胞排列紊亂，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在空泡，肝組織內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集，肝細(xì)胞呈現(xiàn)片狀壞死；而熊果酸小、中、大劑量組肝細(xì)胞索排列均有不同程度的改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及壞死區(qū)域降低明顯(圖1)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。

2.2沙棘熊果酸對(duì)酒精所致肝損傷大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量的影響見表1。模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；而熊果酸中、大劑量組大鼠血清ALT、AST的活力及肝臟TG含量均明顯降低(P<0.05)，且逐漸接近于正常對(duì)照組，熊果酸小劑量組大鼠血清ALT、AST的活力及肝臟TG含量與模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5組大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量比較

2.3沙棘熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響TUNEL結(jié)果顯示，正常對(duì)照組染色較淡，偶見凋亡細(xì)胞；模型對(duì)照組染色不均勻，可見大量棕褐色固縮或呈碎片狀的細(xì)胞核，且染色的陽性細(xì)胞多集中在肝小葉、中央靜脈肝附近，肝細(xì)胞凋亡率高達(dá)77%，與正常對(duì)照組比較，明顯增高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，熊果酸小、中、大3個(gè)劑量組染色陽性細(xì)胞逐漸減少，染色變淺，核碎裂現(xiàn)象明顯降低，凋亡率分別為63%，47%和30%，且熊果酸小劑量組與熊果酸大劑量組比較，肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)(圖2和圖3)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。①與正常對(duì)照組比較，t=-69.823～-9.457，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=3.561～17.611，P<0.05；③與熊果酸小劑量組比較，t=-6.767，P<0.05。

2.4沙棘熊果酸對(duì)ALD大鼠肝組織Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織中Bcl-2蛋白表達(dá)量降低明顯(P<0.05)，Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯增高(P<0.05)；熊果酸中、大劑量干預(yù)的大鼠相較模型對(duì)照組而言，肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，而熊果酸小劑量組大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)量無明顯差異，熊果酸大劑量組大鼠肝組織Bax蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，熊果酸小劑量組、中劑量組大鼠肝組織Bax蛋白表達(dá)量與模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，熊果酸中、大劑量組大鼠肝組織cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，但熊果酸小劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組；①與正常對(duì)照組比較，t=-19.682～12.778，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=-14.409～20.195，P<0.05；③與熊果酸小劑量組比較，t=-11.288～15.734，P<0.05。

3 討論

目前關(guān)于大鼠酒精致肝損傷的造模方式有4種：自由飲用模型、胃內(nèi)喂養(yǎng)模型、腹腔注射模型及酒精灌胃模型[8]，但由于飲用量無法控制、攝入途徑不符合等不可控因素，本研究選用酒精灌胃方式，與酒精誘導(dǎo)肝損傷的生理生化和病理特征及人的飲酒習(xí)慣相結(jié)合，給予階梯式灌胃，成功建立酒精致肝損傷大鼠模型[9]。HE染色觀察肝組織變化是臨床上反映肝臟損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，ALT和AST是檢測(cè)肝臟損傷的敏感指標(biāo)[11]，其活性水平的高低可在一定程度上體現(xiàn)生物體內(nèi)肝細(xì)胞損傷的情況[12]。實(shí)驗(yàn)表明，慢性酒精中毒可引起肝細(xì)胞中TG不能正常輸出，導(dǎo)致肝臟中TG的堆積[13]。本研究表明，模型對(duì)照組血清ALT、AST及肝組織TG含量均明顯升高，肝細(xì)胞部分呈現(xiàn)片狀壞死，肝細(xì)胞索排列不規(guī)則，且存在大量脂肪空泡，這與肝損傷導(dǎo)致TG堆積互相印證。而經(jīng)熊果酸干預(yù)8周后，大鼠肝細(xì)胞壞死程度明顯降低，肝細(xì)胞索排列較為整齊，血清ALT、AST及肝組織TG含量均有不同程度下降。

長(zhǎng)期攝入酒精可致生物體內(nèi)肝細(xì)胞異常凋亡，其凋亡程度與酒精致肝損傷程度呈正相關(guān)[14]，故如何減輕肝細(xì)胞凋亡程度對(duì)ALD的預(yù)防與治療具有重要意義。參與肝細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的基因有許多，與其關(guān)系最密切的調(diào)控基因?yàn)锽cl-2家族的Bcl-2及Bax基因[15]。Bcl-2基因具有抗肝細(xì)胞凋亡的作用，而Bax基因可促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，這對(duì)基因分別以同源及異源二聚體存在[16]。當(dāng)Bcl-2過表達(dá)時(shí)形成異源二聚體Bcl-2-Bax，可有效減輕多因素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bax過表達(dá)時(shí)形成Bax同源二聚體，可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。因此，Bcl-2與Bax的表達(dá)在體內(nèi)常呈現(xiàn)一種平衡狀態(tài)。一旦失衡，將對(duì)肝細(xì)胞的存活或凋亡產(chǎn)生影響。通過增加Bcl-2的表達(dá)可抑制caspase-3的激活而減緩肝細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[18]。細(xì)胞凋亡的程序啟動(dòng)大多由天冬氨酸的特異水解酶(caspase)引發(fā)，caspase-3是caspase家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)過程中最主要的執(zhí)行者[19]。caspase-3在一般情況下以無活性的酶原(Pro-caspase)形式存在，當(dāng)肝細(xì)胞凋亡程序被激活時(shí)，Pro-caspase將轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牧呀鈉aspase-3，其可促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡過程[20]。所以，cleaved caspase-3常被作為判斷肝細(xì)胞凋亡情況的重要指標(biāo)之一。caspase-3激活將使Bcl-2的功能由抑制凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)橛|發(fā)凋亡，而阻止caspase-3的激活將抑制Bcl-2的降解[21]。本研究結(jié)果顯示，熊果酸組大鼠肝組織中Bax蛋白表達(dá)明顯受到抑制，而Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增加，阻止caspase-3的活化。提示熊果酸可能通過調(diào)節(jié)肝組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)起到抗凋亡作用，進(jìn)而發(fā)揮防治ALD的作用。

綜上所述，沙棘熊果酸能夠明顯改善ALD，其機(jī)制可能為調(diào)節(jié)抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而降低肝細(xì)胞異常凋亡。因此，沙棘熊果酸可作為一種具有潛在保肝作用及藥用價(jià)值的天然植物化合物，值得進(jìn)一步開發(fā)和研究。