微量法測(cè)定土壤酶活性的實(shí)驗(yàn)步驟

葛永翠

（蘭州中大司法鑒定所，甘肅 蘭州 730030）

1.微量法測(cè)定土壤β-葡萄糖苷酶活性

1.1 實(shí)驗(yàn)的意義

土壤β-葡萄糖苷酶（S-β-GC）能夠催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖，是纖維素分解酶系中重要的組成成分之一，在土壤微生物的糖類(lèi)代謝方面具有重要的生理功能。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

S-β-GC能夠催化對(duì)-硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有特征光吸收。

1.3 實(shí)驗(yàn)所要的耗材

烘箱、研缽、白紙、自封袋、30-50目篩子、萬(wàn)分之一電子天平、稱(chēng)量紙、藥匙、離心管、離心管板、移液器10ul100ul200ul、移液槍頭10ul200ul、96孔板、振蕩器、離心機(jī)、水浴鍋、酶標(biāo)儀：S-β-GC試劑盒、蒸餾水、甲苯

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

土樣的前處理，將新鮮的土樣放在37°烘箱中烘干待用；用研缽研磨并過(guò)30～50目篩子，仔細(xì)收集過(guò)篩的土樣即為風(fēng)干的土樣，裝進(jìn)自封袋并用記號(hào)筆編上編號(hào)，方便做樣和處理數(shù)據(jù)；

稱(chēng)取0.02g風(fēng)干土樣分別于1.5ml的離心管中，一個(gè)是對(duì)照管，一個(gè)是測(cè)定管，并作三平行；

給對(duì)照管和測(cè)定管各加入10ul的甲苯，震蕩混勻15分鐘，加入試劑盒里面的試劑三各160ul,其中測(cè)定管在加入試劑盒里面的試劑二130ul，對(duì)照管加入130ul的蒸餾水是體系達(dá)到平衡，反應(yīng)總體積都是300ul；

37°控溫振蕩器里面催化反應(yīng)一小時(shí)，一定迅速拿出來(lái)，結(jié)束催化反應(yīng)，使得到的數(shù)據(jù)更佳準(zhǔn)確；

將離心管放入90°水浴鍋中煮沸5min，注意放入前一定壓緊離心管的蓋子，以免沸水浴的時(shí)候會(huì)崩開(kāi)蓋子，使其水分蒸發(fā)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好把水浴鍋的蓋子不要蓋緊，留一個(gè)開(kāi)口，蓋子崩開(kāi)的幾率就會(huì)變?。?/p>

取出離心管迅速冷水冷卻，擦拭后放入常溫離心機(jī)里離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速為10000g，離心10min,取其上清液70ul于96孔板中，加入試劑盒中的試劑四130ul，充分混勻，注意：混勻的時(shí)候96孔板在桌面來(lái)回輕輕搖晃，避免灑出導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；

靜置2min后，將96孔板放入酶標(biāo)儀曹里，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀在400nm處，讀取吸光度數(shù)據(jù)，并保存；

根據(jù)公式計(jì)算其活性；y=225*(△A+0.0027)，△A為測(cè)定管吸光度-對(duì)照管吸光度（結(jié)果見(jiàn)表1）。

2.土壤纖維素酶的活性（S-CL）

2.1 實(shí)驗(yàn)的意義

土壤纖維素酶活性來(lái)源于土壤微生物，土壤纖維素酶催化農(nóng)作物秸稈產(chǎn)生的葡萄糖是主要的碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 實(shí)驗(yàn)的原理

采用蒽酮比色法測(cè)定S-CL催化纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

2.3 實(shí)驗(yàn)所要的耗材

烘箱、研缽、白紙、30-50目篩子、自封袋、電子天平（萬(wàn)分之一）、稱(chēng)量紙、藥匙、離心管、離心管板、移液器100ul200ul1000ul、移液槍頭200ul1000ul、96孔板、振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、酶標(biāo)儀、土壤纖維素酶（S-CL）試劑盒、蒸餾水、濃硫酸、甲苯。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

土樣前處理與土樣β-葡糖糖苷酶的步驟中的1一樣；

稱(chēng)取土樣0.05g分別置于1.5ml的離心管中，每一個(gè)測(cè)定管設(shè)置一個(gè)對(duì)照管，分別編號(hào)如tr1和tr-1，并作三平性；

分別加入甲苯50ul，振蕩混勻15min；給測(cè)定管加入試劑二90ul,試劑三370ul,蒸餾水90ul,對(duì)照管加入試劑三370ul,蒸餾水180ul,使得體系是600ul；

放入37°控溫振蕩器中，催化反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束立即取出放入90°水浴鍋煮沸15min；在轉(zhuǎn)移到8000g,常溫離心機(jī)里離心10min,移取上清液140ul于96孔板中，加入終止液260ul,輕輕混勻；

放入酶標(biāo)儀曹里，設(shè)置波長(zhǎng)為620nm,檢測(cè)其吸光度，并用公式：y=38.3*(△A+0.0462)，△A同上，計(jì)算出纖維素酶活性；得到的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1中。

3.土壤脲酶活性檢測(cè)

3.1 實(shí)驗(yàn)意義

土壤脲酶能夠水解尿素，產(chǎn)生氨和碳酸；土壤脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量成正相關(guān)；土壤脲酶活性反應(yīng)了土壤的氮素狀況。

3.2 實(shí)驗(yàn)原理

利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH3-N。

3.3 實(shí)驗(yàn)耗材

研缽、白紙、篩子、自封袋、烘箱、電子天平（萬(wàn)分之一）、稱(chēng)量紙、藥匙、離心管、離心管板、振蕩器、水浴鍋、浮漂、移液器20ul、移液器100ul、移液器200ul、移液器1000ul、槍頭200ul、槍頭1000u、離心機(jī)、96孔板、計(jì)時(shí)器、培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、甲苯、土壤脲酶試劑盒、蒸餾水。

3.4 實(shí)驗(yàn)步驟

稱(chēng)取風(fēng)干土樣0.05g于1.5ml離心管中，每一個(gè)測(cè)定管設(shè)置一個(gè)對(duì)照管，并編號(hào)為tr1和tr-1，做三平行；

分別都加入甲苯20ul，其中測(cè)定管加入試劑90ul,試劑三190ul,對(duì)照管里依次加入蒸餾水90ul,試劑三190ul；

37°水浴鍋催化反應(yīng)24小時(shí)，下午2點(diǎn)放入，次日下午2點(diǎn)取出，迅速常溫離心，設(shè)置為10000g，10min，取其上清液于并稀釋10倍；

移取稀釋后的上清液80ul于96孔板中，輕輕混動(dòng)，切勿灑出；

靜置2min后加90ul蒸餾水，放入酶標(biāo)儀槽里，設(shè)置波長(zhǎng)578nm,得到吸光值，根據(jù)公式：y=1312*(△A-0.0373)，△A同上，計(jì)算出脲酶活性，數(shù)據(jù)在表一中。

4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

土壤酶活性（單位） 樣品編號(hào) 測(cè)定管 對(duì)照管 計(jì)算公式 結(jié)果B1 0.8714 0.6878 41.9175 B2 0.9977 0.8099 42.8625 B3 0.9921 0.8018 43.4250 β-葡萄糖苷酶(umol/d/g)y=225*(△ A+0.0027)C1 0.9002 0.1598 922.4672 C2 0.8854 0.1428 925.3536 C3 0.8527 0.1093 926.4032脲酶(ug/d/g)y=1312*(△ A-0.0373)51.7318 D2 2.1221 0.8117 51.9578 D3 2.0645 0.7757 51.1305 D1 1.8963 0.5918纖維素酶（(mg/d/g)）y=38.3*(△ A+0.0462)

通過(guò)吸光度計(jì)算其活性，得到這份土壤的β-葡萄糖苷酶活性、脲酶活性和維素活性的三個(gè)指標(biāo)，其平均數(shù)分別是42.7333umol/d/g、924.7413ug/d/g、51.6067mg/d/g，同理也可以用微量檢測(cè)土壤的酶含量，研究土壤酶含量和活性，能幫助我們定性定量地改變土壤，提高其利用率。