劉文立 莫海云(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腫瘤科,衡陽 421002)
結(jié)腸癌作為胃腸道常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨,目前臨床上治療人結(jié)腸癌的首選方法為手術(shù)切除并輔以化療,但化療會對正常細(xì)胞造成一定的損傷且易于復(fù)發(fā),部分患者因不能忍受其痛苦過程而放棄治療,且抗腫瘤化療藥物毒副作用大,長期使用易產(chǎn)生耐藥[1-2]。中藥因其療效好、毒副作用少而在腫瘤的治療中體現(xiàn)了獨(dú)特優(yōu)勢。近年來,免疫類中藥多糖因具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤活性顯著和毒副作用小等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床輔助治療[3-4]。白及多糖(bletilla striata polysaccharide,BSP)是中藥白及中分離制備得到的一種具有確定組成和結(jié)構(gòu)的新型葡萄甘露聚糖,有關(guān)其止血、抗胃潰瘍、免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)等藥效已多有報道[5-6]。本研究通過觀察白及多糖對結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用,探討其可能調(diào)節(jié)機(jī)制,以期為白及多糖的臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。
1.1 材料 小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。30只SPF級健康BALB/c裸鼠,鼠齡6~7周,體重(20±2)g,由湖北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供,動物合格證編號:SCXK(鄂)2018-0020。白及多糖購于陜西慈緣生物科技有限公司,批號:20180913;香菇多糖購于陜西方晟生物科技有限公司,批號:BZ-201;MTT檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-2、IFN-γELISA試劑盒購于美國R&D公司;APC-CD3e抗體、PE-CD4抗體、PE-CD8a抗體均購自美國BD公司;TLR4、My D88、NF-κB p65抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Science公司;全自動生化分析儀購于Beckman Coulter公司;全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司;流式細(xì)胞儀購于美國貝克曼庫爾特公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型建立 右前肢皮下接種CT26細(xì)胞(0.2 ml,1×107個/ml),接種1周左右時,接種處可見平均直徑約5 mm的腫瘤視為造模成功[7]。
1.2.2 動物分組與給藥 將模型裸鼠分為荷瘤模型組(Model)、白及多糖低劑量組[BSP-L,100 mg/(kg·d)]、白及多糖高劑量組[BSP-H,400 mg/(kg·d)]和陽性藥物香菇多糖組[LNT,150 mg/(kg·d)],每組6只;另取6只健康裸鼠作為對照組(Control)。皮下接種1周后開始灌胃給藥,連續(xù)給藥3周,其中對照組和模型組每天給予與藥物組等量生理鹽水灌胃[8]。
1.2.3 腫瘤生長曲線繪制及抑瘤率計算[9]從接種腫瘤細(xì)胞第1天起,每3 d用游標(biāo)卡尺測量1次腫瘤的長徑(a)和短徑(b),計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。末次給藥24 h后,頸椎脫臼處死小鼠,取瘤稱重計算抑瘤率。其中,腫瘤體積:V=ab2/2;抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量)×100%。
1.2.4 免疫器官指數(shù)計算[10]摘眼球取血,頸椎脫臼法處死小鼠,取各組小鼠脾臟和胸腺,稱量質(zhì)量,計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/鼠體質(zhì)量(g)。
1.2.5 MTT法測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性[11]收集各組小鼠脾臟組織制成單細(xì)胞懸液,PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103個/孔接種于96孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分組處理后每孔加20μl MTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清,每孔加入150μl DMSO溶解液,置于搖床低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(OD490),以O(shè)D490值表示細(xì)胞活力。
1.2.6 ELISA法檢測血清免疫因子水平[12]摘眼球取血,3 000 r/min離心5 min分離血清,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中IL-2和IFN-γ含量。
1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群[11]另取肝素抗凝血20μl,加入180μl紅細(xì)胞裂解液,混勻后,靜置10 min棄去上清液,PBS沖洗2次后重懸白細(xì)胞,加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體混合抗體,避光孵育15 min后上機(jī)檢測,收集數(shù)據(jù),Cellqeust軟件分析CD4+T細(xì)胞(CD3e+CD4+)、CD8+T細(xì)胞(CD3e+CD8+)百分比,并計算CD4+/CD8+。
1.2.8 Western blot法檢測脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平[12]取各組小鼠脾臟組織稱質(zhì)量后加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿,冰上碾磨組織,4℃條件下12 000 g離心20 min,收集上清,采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體和β-actin抗體,4℃孵育過夜。次日,加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,ECL試劑曝光顯影,在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。目的蛋白的相對表達(dá)量用目的蛋白與β-actin灰度值比表示。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 如圖1所示,BSP-H組和LNT組移植瘤生長較Model組緩慢,且接種第22天時BSP-H組和LNT組移植瘤體積顯著小于Model組(P<0.01),而BSP-L組與Model組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。如表1所示,與Model組相比,BSP-H組和LNT組移植瘤重量顯著降低(P<0.01),抑瘤率顯著增加(P<0.01),而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
圖1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.1 Effects of BSP on tumor growth in tumor-bearing mice
表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s,n=6)Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice(±s,n=6)
表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s,n=6)Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice(±s,n=6)
Note:1)P<0.01,compared with Model group.
Inhibition rate(%)0 4.10 62.801)78.161)Groups Model BSP-L BSP-H LNT Tumor weight(g)2.93±1.10 2.81±0.62 1.09±0.711)0.64±0.871)
2.2 白及多糖對荷瘤小鼠免疫器官的影響 如表2所示,與Control組相比,Model組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著下降(P<0.01);與Model組相比,BSPH組和LNT組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著上升(P<0.01),而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響(±s,n=6,mg/g)Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice(±s,n=6,mg/g)
表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響(±s,n=6,mg/g)Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice(±s,n=6,mg/g)
Note:1)P<0.01,compared with Control group;2)P<0.01,compared with Model group.
Thymus index 5.73±0.45 4.01±0.361)4.75±0.17 5.22±0.502)5.27±0.282)Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT Spleen index 8.61±0.60 6.53±0.331)7.23±0.37 7.90±0.182)8.12±0.192)
2.3 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響 如圖2所示,與Control組相比,Model組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05);與Model組相比,BSP-H組和LNT組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著上升(P<0.05),而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
圖2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of BSP on lymphocyte activity in spleen of tumor-bearing mice
2.4 白及多糖對荷瘤小鼠血清免疫因子水平的影響 如圖3所示,與Control組相比,Model組小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01);與Model組相比,BSP-H組和LNT組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上調(diào)(P<0.05),而BSPL組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
圖3 白及多糖對荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影響Fig.3 Effects of BSP on IL-2 and IFN-γlevels in serum of tumor-bearing mice
2.5 白及多糖對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 如表3所示,與Control組相比,Model組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05);與Model組相比,BSP-H組和LNT組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著上升(P<0.05),而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響(±s,n=6)Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice(±s,n=6)
表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響(±s,n=6)Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice(±s,n=6)
Note:1)P<0.05,compared with control group;2)P<0.05,compared with model group.
CD4+/CD8+1.77±0.27 0.80±0.211)1.00±0.26 1.46±0.192)1.63±0.262)Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT CD4+(%)43.43±4.08 25.73±4.821)29.38±2.55 38.73±3.222)40.97±5.272)CD8+(%)24.50±2.91 32.17±3.351)29.33±3.07 26.60±2.872)25.02±2.492)
2.6 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示,與Control組相比,Model組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與Model組相比,BSP-H組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NFκB p65蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.01),而BSP-L組和LNT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
圖4 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NFκB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of BSP on protein expressions of TLR-4,MyD88,NF-κB p65 in spleen tissue of tumor-bear-ing mice
由于結(jié)構(gòu)上的多樣性和復(fù)雜性,多糖已成為當(dāng)今最有魅力的信息載體之一。自上世紀(jì)80年代至今,已相繼報道了至少多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)作用等多種生理活性的多糖,其中最重要的活性當(dāng)推免疫調(diào)節(jié)作用。多糖因其增強(qiáng)機(jī)體免疫、輔助抗腫瘤及幾乎沒有毒性等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[13]。本研究結(jié)果顯示,白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路,增強(qiáng)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能,從而起到抑制腫瘤生長的作用。
腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體免疫功能的下降密切相關(guān),脾臟和胸腺為重要的免疫器官,是發(fā)生免疫應(yīng)答及合成免疫活性物質(zhì)的重要場所,脾臟和胸腺指數(shù)在一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低,與模型組相比,白及多糖高劑量組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著上升。說明腫瘤的出現(xiàn)引起了機(jī)體免疫器官的萎縮,而白及多糖具有降低模型小鼠脾臟和胸腺損傷的作用,能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。
腫瘤免疫分為免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸3個階段,在免疫清除期,免疫系統(tǒng)可抑制腫瘤生長,起到免疫清除作用,其中IFN-γ、IL-2發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組荷瘤小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調(diào),與模型組相比,白及多糖高劑量組的小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上升。說明白及多糖可通過調(diào)節(jié)血清免疫因子水平,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。
腫瘤可使機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)生異常改變。細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群的改變,CD4+輔助性T細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答;CD8+T細(xì)胞可通過分泌抑制因子抑制CTL細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞,起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。兩種作用迥異的T淋巴細(xì)胞借其相互拮抗作用以保持免疫功能的平衡[15]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著下降,外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例降低,CD8+T淋巴細(xì)胞比例升高,CD4+/CD8+比值降低。與模型組相比,白及多糖高劑量組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著上升,外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例上調(diào),CD8+T淋巴細(xì)胞比例下調(diào),CD4+/CD8+比值上升。提示白及多糖可增加小鼠體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量,并通過上調(diào)CD4+T細(xì)胞,提高機(jī)體抗腫瘤能力。
TLR4/NF-κB通路是近些年來發(fā)現(xiàn)與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的信號通路,NF-κB信號通路受多種上游信號分子刺激而激活,TLR4是其中之一,其主要表達(dá)在免疫細(xì)胞表面,在介導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)及中藥多糖主導(dǎo)的免疫力提升和細(xì)胞因子釋放中發(fā)揮重要作用[16]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低,與模型組相比,陽性藥物香菇多糖脾臟組織中相關(guān)蛋白無明顯變化,這主要與香菇多糖的作用機(jī)制有關(guān),其主要是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力間接發(fā)揮抗腫瘤作用,而白及多糖高劑量組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著上升,提示白及多糖對腫瘤的抑制作用與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。
綜上所述,白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路,增強(qiáng)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能,從而起到抑制腫瘤生長的作用。且其在調(diào)節(jié)免疫功能方面的療效與目前廣泛應(yīng)用于臨床的香菇多糖無明顯差異,說明白及多糖具有很大的開發(fā)利用價值。