黃啟雪，張夢璐，張志錦，邢智洋，朱河水，王月影，付 彤，高騰云，韓立強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

在奶牛飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高精料/低粗料日糧或飼糧中添加油脂都會造成牛乳中乳脂肪含量降低，形成低脂乳癥現(xiàn)象(milk fat depression，MFD)。對此現(xiàn)象，前人在研究過程中提出了多個(gè)理論進(jìn)行解釋，如脂肪動員學(xué)說、乙酸不足學(xué)說、胰島素-葡萄糖學(xué)說等。反式脂肪酸理論認(rèn)為，是日糧在瘤胃氫化過程中產(chǎn)生的反式脂肪酸(trans-FA)導(dǎo)致了乳脂肪降低[1]，后來 Bauman 和Griinari[2]通過試驗(yàn)明確提出，油脂在瘤胃的代謝產(chǎn)物共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)可以有效抑制乳腺脂肪合成。共軛亞油酸(CLA)是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一系列在碳9、11或10、12位具有共軛雙鍵的高不飽和脂肪酸[3]。研究發(fā)現(xiàn)，給奶牛飼喂共軛亞油酸鈣，或者腸道灌注 trans-10，cis-12 CLA[4-6]，會導(dǎo)致奶牛發(fā)生MFD，改變了乳中脂肪含量與脂肪酸組成，也調(diào)控了乳腺組織的基因表達(dá)，但對此過程的內(nèi)在機(jī)理還存在很多未知之處。

乳脂肪以脂肪球(milk fat globule，MFG)的形式從哺乳動物的乳腺中分泌到乳中。每毫升牛乳中，大約有 150 億個(gè)脂肪球，以大小不同的小液滴形狀分散存在于乳中形成乳濁液。乳脂肪球顆粒直徑大小從 0.2 μm 到 15 μm 不等[7]，主要受到動物種類[8]、遺傳傾向[9]、泌乳時(shí)期[10]、季節(jié)和營養(yǎng)[11]的影響。研究發(fā)現(xiàn)，乳脂肪球的粒徑大小與乳脂肪含量有顯著相關(guān)性[12]，直接影響了乳品的營養(yǎng)特性和動物的腸道吸收，不同粒徑的脂肪球還能夠改變奶酪等下游乳產(chǎn)品的加工性質(zhì)[13]。一些飼料營養(yǎng)因素可以改變脂肪球的直徑，Argov-Argaman等[14]采用高精料日糧飼喂奶牛，發(fā)現(xiàn)脂肪球的平均粒徑從 3.51 μm 減少到 3.3 μm。那么飼喂奶牛 CLA 造成乳脂肪含量減少的同時(shí)，是不是也伴隨著脂肪球粒徑大小的變化？這個(gè)問題目前還不清楚。因此，本研究通過在荷斯坦奶牛日糧中添加CLA，采用激光粒度儀檢測其對乳脂肪球粒徑大小及分布的影響，為從乳脂肪球角度闡明反式脂肪酸造成奶牛 MFD 的內(nèi)在機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選擇24頭泌乳中期荷斯坦奶牛，試驗(yàn)?zāi)膛５娜占Z參照NRC(2001)中育成奶牛營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)所用奶牛在同一雙列式牛舍內(nèi)飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間采用TMR日糧，按照自由采食，自由飲水的方式進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)分組

選取24頭體型、身體狀況、產(chǎn)犢日期相近的泌乳中期荷斯坦奶牛(體重(583±34.6)kg，產(chǎn)奶量(27.2±2.4)kg·d-1)隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭牛，分別為對照組(C group)飼喂基礎(chǔ)日糧(表1)，低劑量組(L group)每頭飼喂基礎(chǔ)日糧+150 g·d-1CLA；中劑量組(M group)飼喂基礎(chǔ)日糧+300 g·d-1CLA；高劑量組(H group)飼喂基礎(chǔ)日糧+400 g·d-1CLA。整個(gè)飼養(yǎng)周期為7 d，包括2 d適應(yīng)期和5 d試驗(yàn)期，每天分別在07:00和16:00飼喂，每天擠奶3次。試驗(yàn)用共軛亞油酸微囊粉購自青島澳海生物有限公司，其中分別含有cis-9，trans-11 CLA 39.6%和trans-10，cis-12 CLA 39.4%。

表1 奶牛基礎(chǔ)日糧的成分和化學(xué)組成Table 1 Ingredient and chemical composition of the basal diets of cows g·kg-1 DM

1.3 樣品采集

試驗(yàn)期間每天記錄奶牛采食量和產(chǎn)奶量，試驗(yàn)期每天收集一次乳樣，每頭奶牛在早、中、晚按30∶40∶30取樣后制成混合乳樣，每天將50 mL混合乳樣送至河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心采用乳成分分析儀(Foss 120 Milko-Scan，丹麥)進(jìn)行乳脂、乳蛋白、乳糖含量的檢測；在飼喂試驗(yàn)的第5天取中午的奶樣，迅速將其送到實(shí)驗(yàn)室，采用激光粒度分析儀(Mastersizer 3000，英國)檢測乳脂肪球粒徑。

1.4 乳脂肪球染色觀察

對鮮牛乳的脂肪球進(jìn)行尼羅紅染色。吸取1 mL 牛奶樣品，加入4 mL超純水進(jìn)行稀釋，加入1 mL 尼羅紅染料(100 μg·mL-1)，混勻后避光反應(yīng)20 min；取適量染色后的樣品與瓊脂糖(5 g·L-1)等量混合后滴到玻底皿中，用倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73，日本)觀察。

1.5 乳脂肪球粒徑分析

采用激光粒度分析儀檢測新鮮牛乳樣品的脂肪球粒徑。根據(jù)Mastersizer 3000激光粒度分析儀的濕法指南進(jìn)行操作，設(shè)置激光折射率(純水=1.330，牛乳=1.560)，攪拌器速度2 000 r·min-1。向燒杯中加入400 mL水，然后將攪拌器放入燒杯中。單擊開始按鈕以初始化儀器和測量背景，然后將1 mL 的牛乳樣品添加到燒杯中，直到激光度指示為10%～20%。系統(tǒng)將自動測量3次并計(jì)算平均值。使用Mastersizer軟件對每個(gè)樣品的獲取值進(jìn)行分析，生成數(shù)據(jù)包括體積相關(guān)直徑D[4,3]，表面積相關(guān)直徑D[3,2]，粒度分布圖和粒度分布百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25(SPSS / IBM Corp.，Chicago，IL)的通用線性模型(GLM)中重復(fù)測量方差分析CLA處理主效應(yīng)對產(chǎn)奶量和采食量、乳成分的影響。采用單因素方差分析(one way ANOVA)比較CLA處理對脂肪球粒徑及分布比例的影響。以P>0.05 表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乳脂肪球染色及粒徑分布圖

如圖1A所示，乳脂肪球用尼羅紅染色后顯示紅色熒光(圖1A中發(fā)亮之處)，表明在牛乳中存在直徑大小不一的脂肪球。牛乳的粒徑分布如圖1B所示，可以看出，乳脂肪球的粒徑主要分布在1～10 μm之間。

圖1 牛乳脂肪球染色(A)和粒徑分布圖(B)Fig.1 Milk fat globules staining(A) and particle size distribution diagram(B)

2.2 不同劑量CLA對奶牛生產(chǎn)性能和乳成分的影響

由表2可知，各組間的產(chǎn)奶量和采食量沒有顯著差異(P>0.05)；從乳成分的變化可以看出，CLA處理對乳糖和乳蛋白的含量沒有顯著影響，但隨著CLA添加水平的增加，處理組牛乳中脂肪的含量極顯著降低(P<0.01)。M組和H組的乳脂肪分別為 2.34 g·dL-1和2.23 g·dL-1，比對照組分別降低了34.82%和37.88%。

表2 CLA對奶牛生產(chǎn)性能及乳成分的影響Table 2 Effects of CLA on the production performance and milk composition of dairy cows

2.3 不同劑量CLA對脂肪球粒徑大小和比例的影響

由表3可知，隨著CLA添加劑量的加大，顯著降低了處理組的乳脂肪球粒徑(P<0.05)，其中，M組和H組的脂肪球粒徑D[3,2]和D[4,3]均顯著低于C組。進(jìn)一步分析不同大小脂肪球占牛乳總脂肪球的比例發(fā)現(xiàn)，隨著CLA添加劑量的增大，小脂肪球所占總百分比逐漸增加，而大脂肪球所占百分比逐漸減少(表4)。分布在1.54～2.58 μm 的小脂肪球，H組和M組的百分比顯著高于C組和L組(P<0.05)，呈現(xiàn)出H組、M組>L組>C組的變化；分布在4.88～6.30 μm 的大脂肪球，H組和M組的比例顯著低于C組和L組(P<0.05)，呈現(xiàn)出M組、H組

表3 CLA對牛乳脂肪球粒徑的影響Table 3 Effects of CLA on the milk fat globule size

表4 CLA對不同粒徑牛乳脂肪球比例的影響Table 4 Effects of CLA on the proportion of milk fat globules with different particle sizes

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，相較于小粒徑MFG，粒徑大的牛MFG含有的宿主防御蛋白含量更高，說明可以通過改變牛乳中MFG粒徑來增強(qiáng)機(jī)體的保護(hù)功能[15]。MFG粒徑也直接影響了下游食品加工中干酪成熟與乳制品保質(zhì)期[16-17]。用小粒徑MFG生產(chǎn)出的干酪具有較高熔點(diǎn)、較強(qiáng)彈性和較好的流動性等特點(diǎn)[18]。工業(yè)上均質(zhì)化技術(shù)可以減小MFG的粒徑差異，均質(zhì)化后形成的脂肪球膜在物理和化學(xué)特性上也有較大差異[19-20]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，泌乳期奶牛進(jìn)行CLA處理，能夠顯著降低乳中脂肪含量和脂肪球粒徑，并且改變了不同粒徑乳脂肪球的比例，這對于生產(chǎn)富含小脂肪球的牛乳制品提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。

對于CLA引起的低脂乳癥已經(jīng)進(jìn)行過很多研究。Perfield等[21]連續(xù)140 d給奶牛飼喂CLA，Viswanadha等[22]在5 d內(nèi)通過頸靜脈將不同劑量CLA直接注射給奶牛，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，CLA只是特異性抑制乳脂肪合成，而對乳蛋白、乳糖和產(chǎn)奶量等奶牛生產(chǎn)指標(biāo)沒有顯著影響，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。這些結(jié)論支持了一個(gè)普遍的觀點(diǎn)，即對于奶牛來說，有效劑量的CLA只會顯著抑制乳脂肪合成而不影響其他乳成分。

脂肪在乳中以脂肪球(MFG)的形式存在，而脂肪球來源于乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)合成的胞漿脂滴(LD)[23]。

雖然對整個(gè)脂滴分泌過程還不是很了解，但目前研究認(rèn)為，脂滴的分泌遵循這樣的細(xì)胞機(jī)制：三酰甘油在乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，體積逐漸增大，并在向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中包裹磷脂和多種蛋白后形成脂滴，脂滴運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞頂漿質(zhì)膜，通過出胞過程分泌到乳汁中形成乳脂肪球[24-25]。本研究采用激光粒度儀檢測發(fā)現(xiàn)，CLA的處理顯著降低了乳脂肪的球直徑，同時(shí)伴隨著小脂肪球比例的增加和大脂肪球比例的減少。Altenhofer 等[26]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在乳脂肪含量與脂肪球直徑之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)合本研究中CLA引起的脂肪降低，推測可能是飼喂CLA改變了奶牛乳腺分泌到乳中脂肪球的大小比例，引起了脂肪球平均粒徑的減少，表現(xiàn)在乳成分上是乳脂肪含量的顯著降低。

目前，CLA對于奶牛的作用機(jī)制主要認(rèn)為是下調(diào)了乳腺脂肪合成基因的表達(dá)[27-29]，而本研究發(fā)現(xiàn)，CLA也會對脂肪球的大小產(chǎn)生影響。在乳腺上皮細(xì)胞中，細(xì)胞脂滴作為乳脂肪球合成的前體，脂滴在細(xì)胞內(nèi)可以相互融合來形成大脂滴[30-31]；脂肪球的粒徑會受到乳中磷脂的影響[32]。脂肪酸的飼喂能夠影響奶牛的代謝[33]，因此，這種CLA引起的乳脂肪球粒徑的變化，究竟是由細(xì)胞內(nèi)的脂滴融合引起[34]，還是由乳腺分泌乳脂肪球本身所導(dǎo)致的，未來還需要更多深入研究。

4 結(jié) 論

本研究通過給奶牛飼喂CLA發(fā)現(xiàn)，乳脂肪發(fā)生明顯降低，同時(shí)乳脂球直徑D[3,2]和D[4,3]均顯著降低，并且伴隨著小脂肪球比例的增加和大脂肪球比例的減少。