上海市某原種雞場(chǎng)禽白血病凈化效果評(píng)估

于慧茹，陶田谷晟，楊顯超，劉健，李鑫，白藝蘭，王建，李凱航，周錦萍

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

禽白血病(avian leukosis)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的以禽類(lèi)造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生為主的一類(lèi)可傳染的腫瘤性疾病[1]。該病為雞群中普遍存在并誘發(fā)腫瘤的三大類(lèi)病之一，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害幾乎波及所有商品雞群。禽白血病的防治尚無(wú)有效疫苗及藥物，各國(guó)主要通過(guò)對(duì)雞群開(kāi)展病毒凈化來(lái)控制該病。由于該病的垂直傳播機(jī)制，從種禽到商品禽會(huì)產(chǎn)生逐級(jí)放大效應(yīng)，因此對(duì)原種禽場(chǎng)的凈化顯得尤為重要。本研究采用禽白血病凈化技術(shù)結(jié)合生物安全防控措施對(duì)上海市某原種雞場(chǎng)開(kāi)展了禽白血病的凈化工作，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代的凈化，原種雞場(chǎng)的禽白血病病原陽(yáng)性率顯著降低，生產(chǎn)性能也得到提高，為原種雞場(chǎng)的禽白血病凈化提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

在對(duì)上海市某原種雞場(chǎng)的某地方品種調(diào)查的基礎(chǔ)上，于2017—2020年對(duì)其保種核心群進(jìn)行連續(xù)4個(gè)世代外源性ALV的檢測(cè)與凈化。試驗(yàn)采集的樣品包括胎糞、種蛋、血液、抗凝血和精液。

1.2 主要試劑

ALV p27抗原、ALV A/B亞群(ALV-A/B)抗體、ALV J亞群(ALV-J)抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司(貨號(hào)分別為99-09257、99-09268、99-09254)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰酶消化液(0.25%)、青鏈霉素溶液(100×)，購(gòu)自GIBCO公司；兩性霉素B，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。DF-1細(xì)胞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院禽病研究室贈(zèng)送。

1.3 樣品的采集及處理

1.3.1 胎糞樣品采集與處理

輕輕擠壓1日齡雛雞腹部，用采樣棉簽在肛門(mén)處沾取糞便置于裝有0.5 mL稀釋液的離心管中，將棉簽頭折斷放于管中，標(biāo)記，用振蕩器進(jìn)行10 s短暫振蕩，液氮凍存。每只母雞的雛雞采集完胎糞后，更換手套或洗手消毒。檢測(cè)前，取出凍存管，靜置3 min后，取上清直接用于p27抗原檢測(cè)。

1.3.2 蛋清樣品采集與處理

每枚雞蛋吸取1 mL左右蛋清置于1.5 mL離心管中，反復(fù)凍融3次。凍存時(shí)可使用液氮罐進(jìn)行速凍，也可用-80 ℃冰箱進(jìn)行凍存，蛋清樣品直接檢測(cè)p27抗原。

1.3.3 血漿樣品采集與處理

母雞全血按照蛋號(hào)進(jìn)行全血采集，公雞全血與精液對(duì)應(yīng)采集。用肝素鈉抗凝管靜脈采集1 mL血液，顛倒混勻3次，2 000 r/min離心2 min，吸取血漿備用。

1.3.4 精液樣品采集與處理

無(wú)菌采集公雞精液50 μL以上，取40 μL加入到160 μL的精液稀釋液(PBS中加入1%雙抗、0.4%兩性霉素B)中，振蕩混勻，3 000 r/min離心2 min備用。

1.3.5 ALV分離培養(yǎng)

吸取100 μL處理好的血漿或精液樣品接種到24孔細(xì)胞板DF-1細(xì)胞中，37 ℃作用2 h。吸附完成后傾去上清，在每個(gè)孔中加入0.5 mL PBS，將細(xì)胞清洗1遍，棄去洗液加入0.5 mL維持液(DMEM培養(yǎng)液中加入1% PBS、1%雙抗、0.4%兩性霉素B)。將24孔板維持生長(zhǎng)9 d，收集細(xì)胞上清進(jìn)行p27抗原檢測(cè)。

1.3.6 檢測(cè)方法

將處理好的血清按照IDEXX公司ALV-A/B、ALV-J 抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)處理好的胎糞、蛋清及血漿、精液的病毒分離細(xì)胞上清，按照IDEXX公司ALV- p27抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行p27抗原檢測(cè)。

1.4 原種雞場(chǎng)摸底調(diào)查

隨機(jī)采集雞場(chǎng)種母雞抗凝血200份，公雞抗凝血、公雞精液各50份，種蛋250份，進(jìn)行 ALV- p27抗原檢測(cè)；公雞、母雞全血各50份，進(jìn)行ALV- A/B抗體、ALV-J抗體檢測(cè)。

1.5 生物安全防控

對(duì)保種場(chǎng)的基礎(chǔ)設(shè)施設(shè)備及生物安全、生產(chǎn)管理等進(jìn)行評(píng)估和完善[2]。配合出雛期紙袋孵化、育雛期隔板阻擋等創(chuàng)新措施降低水平傳播。在消毒管理、無(wú)害化處理、衛(wèi)生環(huán)保等關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)進(jìn)行完善，降低病毒內(nèi)外部傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在生產(chǎn)防疫管理、種源管理、凈化團(tuán)隊(duì)建設(shè)等生產(chǎn)管理要求進(jìn)一步規(guī)范，提升人員防疫意識(shí)。

1.6 凈化方案

參照文獻(xiàn)[3]，在1日齡、育雛后期(12周齡)、初產(chǎn)期(26周齡)、留種前(35周齡)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)展監(jiān)測(cè)。在1日齡進(jìn)行胎糞p27檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體采取同母淘汰；育雛后期采集血漿進(jìn)行病毒分離，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行同群淘汰；初產(chǎn)期分別采集血漿、公雞精液進(jìn)行病毒分離，采集初產(chǎn)蛋3枚普檢，淘汰陽(yáng)性個(gè)體；留種前，采集血漿和精液病毒分離后普檢，淘汰陽(yáng)性個(gè)體。其中該場(chǎng)在0世代全群監(jiān)測(cè)，第1世代開(kāi)始追蹤檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，隨時(shí)調(diào)整檢測(cè)頻率和采樣數(shù)量。

1.7 生產(chǎn)性能評(píng)估

建立相應(yīng)的基準(zhǔn)線，采用同樣的采樣日齡、樣品類(lèi)型和檢測(cè)方法，對(duì)保種群各世代18周齡體重進(jìn)行測(cè)定，56周齡總產(chǎn)蛋數(shù)、繁殖性能(種蛋受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率)、成活率(育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel、SPSS Statistics 26.0軟件對(duì)A保種群各生產(chǎn)性能指標(biāo)進(jìn)行整理與分析，最小顯著差數(shù)法(LSD)對(duì)凈化種雞18周齡體重多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALV流行性調(diào)查

ALV流行性調(diào)查結(jié)果顯示(表1)，該種雞場(chǎng)母雞血漿p27陽(yáng)性率為5.0%，公雞血漿p27抗原陽(yáng)性率為4.0%，公雞精液p27抗原陽(yáng)性率為2.0%，蛋清p27抗原陽(yáng)性率為6.0%。ALV-A/B抗體陽(yáng)性率母雞為36.0%，公雞為4.0%。ALV-J抗體陽(yáng)性率母雞為8.0%，公雞為6.0%，母雞ALV-A/B、ALV-J抗體陽(yáng)性率均高于公雞。

表1 ALV流行性調(diào)查結(jié)果 %

2.2 禽白血病凈化情況

保種群禽白血病凈化檢測(cè)結(jié)果顯示(表2)，經(jīng)過(guò)連續(xù)4個(gè)世代的凈化，核心保種群初產(chǎn)期血漿病毒分離率從第0世代的9.10%降至第3世代的0.50%，公雞精液病毒分離率從第0世代的3.26%降至第3世代的0，初產(chǎn)蛋p27抗原陽(yáng)性率從第0世代的2.04%降至第2世代的0.60%。

表2 凈化監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)匯總

2.3 禽白血病對(duì)雞生產(chǎn)性能影響

隨著凈化的實(shí)施，保種群產(chǎn)蛋性能明顯提高，與凈化起始階段原雞群(0世代)對(duì)比，3世代種雞群56周齡產(chǎn)蛋數(shù)明顯增加，平均凈增8.95個(gè)(見(jiàn)圖1)。

圖1 禽白血病凈化對(duì)雞保種群56周齡產(chǎn)蛋數(shù)的影響

成活率測(cè)定對(duì)比中，經(jīng)過(guò)逐代凈化，育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率均有不同程度的增加，第3世代較第0世代分別增長(zhǎng)3.01%、2.17%和1.48%(見(jiàn)圖2)。

圖2 禽白血病凈化對(duì)雞保種群成活率的影響

繁殖性能方面對(duì)比，種蛋受精率、受精蛋孵化率與0世代基本持平，入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%(見(jiàn)圖3)。

各世代種雞18周齡平均體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，但整體呈逐代增加趨勢(shì)。第3世代相對(duì)第0世代，公雞平均體重增長(zhǎng)35 g，母雞增長(zhǎng)19 g(見(jiàn)表3)。

圖3 禽白血病凈化對(duì)雞保種群繁殖性能的影響

表3 18周齡體重測(cè)定比較 g

3 討論

從流行病學(xué)調(diào)查來(lái)看，該原種雞場(chǎng)禽白血病存在低水平感染，這既是疫病暴發(fā)的隱患也是凈化實(shí)施的良好時(shí)機(jī)。楊榮坤等[4]在地方雞江漢雞進(jìn)行凈化研究中，結(jié)合企業(yè)育種實(shí)際選擇了開(kāi)產(chǎn)初期 22 周齡和留種前35周齡2個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)2個(gè)世代的凈化，p27抗原陽(yáng)性率顯著降低。俞燕等[5]對(duì)4個(gè)地方雞種凈化過(guò)程中，確定了1日齡、育雛轉(zhuǎn)育成6周齡、開(kāi)產(chǎn)初期(25～27周齡)、留種前2周(36～40周齡)等4個(gè)凈化關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。本研究，參照崔治中[3]推薦的技術(shù)方案，結(jié)合該雞種生長(zhǎng)特性及雞場(chǎng)實(shí)際育種情況，選擇種雞生長(zhǎng)階段的1日齡、育雛后期(12周齡)、初產(chǎn)期(26周齡)、留種前(35周齡)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用的方式，增加了陽(yáng)性雞的檢出率。

本研究中，核心保種群初產(chǎn)期血漿病毒分離率從第0世代的9.1%降至第3世代的0.50%，公雞精液病毒分離率從第0世代的3.26%降至第3世代的0。在生產(chǎn)性能方面，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代的凈化，種母雞56周齡產(chǎn)蛋數(shù)平均凈增8.95個(gè)。第3世代育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率較第0世代分別增長(zhǎng)3.01%、2.17%和1.48%。繁殖性能方面，第3世代入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%。俞燕等[5]對(duì)某地方雞種進(jìn)行3個(gè)世代的凈化，25～27周齡蛋清p27抗原陽(yáng)性率由26.4%降至0.3%，36～40周齡血漿病毒分離陽(yáng)性率由36.4%降至0.4%，育雛期、育成期和產(chǎn)蛋期死亡率均逐級(jí)下降；產(chǎn)蛋性能方面66周齡總產(chǎn)蛋數(shù)平均增加了23個(gè)/只。關(guān)于禽白血病低水平感染的凈化報(bào)道較少，本研究中部分生產(chǎn)指標(biāo)雖有所增加，但增長(zhǎng)趨勢(shì)不顯著，可能與雞群本身處于低水平感染相關(guān)。通過(guò)禽白血病的凈化，切實(shí)提升了該種雞群的生產(chǎn)性能及繁殖性能，但其凈化效果在商品代的表現(xiàn)，仍需要進(jìn)一步追蹤。對(duì)于不同的原種雞場(chǎng)來(lái)說(shuō)，沒(méi)有一個(gè)完全相同的凈化標(biāo)準(zhǔn)。凈化方案的制定需要根據(jù)各場(chǎng)的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)及基本流調(diào)情況等實(shí)際情況進(jìn)行制定。

禽白血病凈化是一個(gè)綜合性的工程，徹底完成凈化除了需要科學(xué)有效的方案外，還需要持之以恒的檢測(cè)以及嚴(yán)格的生物安全措施[6]。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)和鑒別診斷ALV 的方法，主要包括病毒的分離與鑒定、病理學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等[7]。病毒的分離與鑒定一直被認(rèn)為是診斷ALV的金標(biāo)準(zhǔn),該方法特異性高，但耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求和檢測(cè)中的儀器要求較高。國(guó)內(nèi)大多數(shù)種雞場(chǎng)不具備批量的病毒分離檢測(cè)條件，需委托具有相應(yīng)資質(zhì)和條件的實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)。目前，適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和凈化的檢測(cè)方法主要還是針對(duì)ALV群特異性抗原p27的ELISA方法[8]。在市場(chǎng)需求和國(guó)家政策引導(dǎo)下，禽白血病凈化將在全國(guó)得到更大范圍的推廣，臨床上仍需要操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、技術(shù)成熟的快速檢測(cè)方法。同時(shí)，完善的生物安全體系建設(shè)和配套硬件設(shè)施是阻斷橫向傳播或其他傳播途徑的有利保障。即使已經(jīng)完成凈化的種禽場(chǎng)仍舊面臨多重感染途徑的再感染風(fēng)險(xiǎn)，必須依靠完善的生物安全體系建設(shè)將疫病擋在門(mén)外[9]?？茖W(xué)的監(jiān)測(cè)淘汰方法、規(guī)范的飼養(yǎng)管理制度、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳锇踩胧┰谝卟艋^(guò)程中缺一不可。

綜上所述，研究選擇多個(gè)凈化關(guān)鍵檢測(cè)節(jié)點(diǎn)，采用血漿和精液病毒分離、胎糞和蛋清禽白血病抗原檢測(cè)等技術(shù)組合的方法檢出并淘汰感染雞，配合出雛期紙袋孵化、育雛期隔板阻擋等創(chuàng)新措施降低水平傳播，制定符合上海市原種雞場(chǎng)實(shí)際、具有可操作性的禽白血病凈化技術(shù)方案，可為其他種雞場(chǎng)凈化工作提供參考。