馬洪雨 ，吳清洋 ，譚華強 ，吳芳春 ，林 鋒

（1.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學(xué)汕頭大學(xué)-馬來西亞登嘉樓大學(xué)蝦蟹貝類聯(lián)合實驗室，廣東 汕頭 515063；3.饒平縣西海岸生物科技有限公司，廣東 饒平 515722）

在水產(chǎn)動物新品種選育過程中，雜交育種方法得到了廣泛的應(yīng)用，創(chuàng)造出了眾多優(yōu)質(zhì)新品種，如：雜交魴鲌“皖江1號”、羅非魚“粵閩1號”、“福瑞鯉2號”、雜交鱘“鱘龍1號”等，提高了成活率、品質(zhì)、抗逆性、生長速度等經(jīng)濟性狀[1-2]，推動了我國水產(chǎn)種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展[3-4].“雜交翹嘴魴”新品種是以雌性團頭魴和雄性翹嘴紅鲌的雜交子一代為母本，以團頭魴為父本，連續(xù)雜交5代獲得的新品種，該品種具有團頭魴的草食性和肉質(zhì)鮮嫩特點，1齡魚體重比團頭魴和翹嘴紅鲌均提高20.0%以上，肌間刺比翹嘴紅鲌減少7.7%[5].雌性團頭魴與雄性鱤雜交產(chǎn)生的子一代群體的可量性狀和可數(shù)性狀更偏向于母本團頭魴，線粒體基因組則與團頭魴完全一致[6].雌性大口黑鱸與雄性藍鰓太陽魚雜交產(chǎn)生的子一代的可數(shù)性狀和可量性狀均介于親本之間，部分性狀超越了雙親，5 S rDNA分析表明雜交子一代融合了雙親的基因組[7].魚類雜交育種技術(shù)相對較成熟，但在蝦蟹類中，雜交育種的理論和實踐研究還處于起步階段，可參考的資料較少.

擬穴青蟹屬節(jié)肢動物門、軟甲綱、十足目、梭子蟹科、青蟹屬，具有肉味鮮美、營養(yǎng)價值高、市場需求大等特點.我國自120多年前便開始養(yǎng)殖擬穴青蟹，近年來，年產(chǎn)量在14萬噸左右，產(chǎn)值達200多億元.雖然我國已經(jīng)突破了擬穴青蟹人工育苗技術(shù)，但還未達到穩(wěn)定量產(chǎn)的水平，生產(chǎn)上還主要依賴從海區(qū)中捕撈野生苗種進行養(yǎng)殖.由于野生苗種存在數(shù)量和質(zhì)量不穩(wěn)定、規(guī)格不一致、易攜帶病菌、產(chǎn)量低等缺點，且養(yǎng)殖過程中面臨不可預(yù)測的病害問題，導(dǎo)致養(yǎng)殖經(jīng)濟效益普遍較低，這極大地限制了我國青蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.

鋸緣青蟹與擬穴青蟹同屬青蟹屬，具有人工育苗成活率高、體型大、生長快、抗逆性強等特點，主要分布在越南、菲律賓、馬來西亞及印度洋周邊國家，我國僅在海南和廣西發(fā)現(xiàn)有少量分布.2005年，日本學(xué)者Hideyuki Imai和Masatsune Takeda在日本發(fā)現(xiàn)了青蟹屬的自然雜交種，后證實是鋸緣青蟹和欖綠青蟹交配所生[8].2021年，馬來西亞學(xué)者Fazhan等在馬來西亞沙巴州發(fā)現(xiàn)了疑似青蟹種間雜交的4種不同子代[9].這些發(fā)現(xiàn)提示我們，青蟹屬內(nèi)不同物種間在自然條件下能夠進行雜交并產(chǎn)生雜種后代.后繼的研究進一步證實，紫螯青蟹、擬穴青蟹和欖綠青蟹在人工條件下可實現(xiàn)種間交配[10-11].目前，還未有擬穴青蟹和鋸緣青蟹種間交配和繁育雜交子代的研究報道.若能建立擬穴青蟹和鋸緣青蟹的種間雜交技術(shù)，則可將鋸緣青蟹易繁殖、生長快速且體型大的優(yōu)勢性狀引入擬穴青蟹中，有望改善擬穴青蟹人工繁殖成活率低、體型相對較小的不足，從而創(chuàng)造出品質(zhì)好、營養(yǎng)豐富、成活率高、生長快、抗逆性強的優(yōu)質(zhì)新品種.

本研究以擬穴青蟹和鋸緣青蟹為親本，建立了種間人工雜交技術(shù)，獲得了雜交子一代苗種，并通過肉眼和顯微觀察技術(shù)鑒定了雜種的表型特征，通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定了雜種的線粒體遺傳特征.本研究將為進一步開展經(jīng)濟蟹類遠緣雜交的理論研究和育種實踐奠定堅實的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 親本來源與養(yǎng)殖

擬穴青蟹來源于課題組自主培育的選育群體，鋸緣青蟹購自海鮮市場.青蟹運送到養(yǎng)殖基地后，首先采用高錳酸鉀溶液進行消毒處理并挑選出符合要求的候選親本，然后養(yǎng)殖于陸基化養(yǎng)殖車間內(nèi)，每個養(yǎng)殖單元養(yǎng)殖一只個體.挑選體型大的個體作為雌雄候選親本，其中，未交配母本的挑選方法如下：觀察雌蟹腹部邊緣是否有明顯的剛毛，若有，則為已交配雌蟹，若無，則為未交配雌蟹（圖1）.養(yǎng)殖方法參照馬洪雨等建立的青蟹陸基高密度循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)[12].海水鹽度保持在20-25 ppt之間，pH值在7.3-8.0之間，氨氮濃度低于0.5 mg/L，亞硝態(tài)氮濃度低于0.1 mg/L.車間內(nèi)溫度控制在25-28℃，以紅肉藍蛤或雜魚為餌料，每天清除餌料殘渣和糞便一次.

圖1 青蟹未交配的雌蟹（A）和已交配的雌蟹（B）腹部特征

1.2 種間人工定向交配

定期巡查青蟹生長狀態(tài)，當發(fā)現(xiàn)雌蟹即將或正在進行生殖蛻殼時，將其移入雜交箱內(nèi)，同時放入一只健康的父本（若母本為鋸緣青蟹，則放入雄性擬穴青蟹；反之，放入雄性鋸緣青蟹），保持雜交箱的溶氧量和水質(zhì)清潔，并提供黑暗環(huán)境.當母本完成生殖蛻殼后，二者可抱對交配，交配時間可持續(xù)1-2 d.

1.3 受孕母本的養(yǎng)殖、營養(yǎng)強化和抱卵母本培育

將交配成功的母本移入海水鹽度為25-30 ppt的種蟹強化培育池中培育，具體方法參考馬洪雨等建立的青蟹種蟹培育技術(shù)[13].種蟹的養(yǎng)殖密度為每平方米1只.以鮮活的螠蟶作為餌料，每天投喂一次，投喂量以第二天早晨剩余3-5個為宜.每天早晨換水一次，換水量為100%，干露1 h.當受孕母本卵巢發(fā)育成熟，便將卵排出體外并附著在腹部下方，此時稱之為抱卵母本.將抱卵母本移至孵化桶中單獨培育10-12 d，直至卵的顏色變?yōu)榛液谏蚝谏珪r便可孵化出蚤狀幼體.

1.4 雜交子一代幼體培育

將孵化出的蚤狀幼體移至幼體培育池中進行培育，具體方法參考馬洪雨等建立的青蟹室內(nèi)水泥池人工育苗技術(shù)[13]，期間做好育苗過程中的餌料、水質(zhì)、溶氧量、病害防控等管理工作.

1.5 雜交子一代表型特征鑒定

隨機采集雜交子一代不同發(fā)育階段的幼體和仔蟹，包括：蚤狀幼體I期（Z1）、蚤狀幼體II期（Z2）、蚤狀幼體III期（Z3）、蚤狀幼體IV期（Z4）、蚤狀幼體V期（Z5）、大眼幼體期（M）、仔蟹 I期（C1）、仔蟹 II期（C2）、仔蟹 III期（C3）、仔蟹 VI期（C6）、仔蟹VII期（C7）.同時，以擬穴青蟹相同發(fā)育階段的幼體和仔蟹作為對照，通過肉眼觀察和借助顯微鏡技術(shù)鑒定不同發(fā)育時期的表型特征.

1.6 雜交子一代線粒體遺傳特征鑒定

隨機采取10只雜交子一代個體及雌雄親本并提取基因組DNA，提取方法為傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法.特異性擴增線粒體細胞色素C氧化酶I亞基（COI）基因的PCR引物序列（COI-s:TTGACCCTGCTGGCGGTGG，COI-a:CAATTGAGGAGGGTAAAAATGGAG TAA）來自于Ma等[14]發(fā)表的論文，委托上海生工生物工程有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為 20 μL，包含：2 μL 10×反應(yīng)緩沖液（含Mg2+），正、反向引物各 0.4 μL，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（北京全式金生物技術(shù)有限公司），0.5 μL DNA模板（50 ng/μL），ddH2O補齊至20 μL.PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，循環(huán)37次；72℃延伸7 min.采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并送至上海生工生物工程有限公司測序.

從GenBank公共數(shù)據(jù)庫中下載擬穴青蟹（Scylla paramamosain）、欖綠青蟹（Scylla olivacea）、紫螯青蟹（Scylla tranquebarica）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）、合浦絨螯蟹（Eriocheir hepuensis）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）及猛蝦蛄（Harpiosquilla harpax）的COI序列，連同本實驗的2個親本及10個雜交子一代個體共計19條序列用于親緣關(guān)系分析.采用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，經(jīng)500次重復(fù)抽樣，檢驗其置信度.設(shè)置猛蝦蛄為外群.

2 結(jié)果與討論

2.1 青蟹種間人工定向交配

本研究共開展了7對雌雄蟹的種間人工定向交配試驗，全部實現(xiàn)了交配，成功率達100%，這說明擬穴青蟹和鋸緣青蟹種間遠緣交配是可行的（圖2）.在自然界中，青蟹屬4個物種間存在棲息地重疊的現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)了種間自然雜交產(chǎn)生的后代，例如：在日本發(fā)現(xiàn)了鋸緣青蟹和欖綠青蟹的雜交種[8]，在馬來西亞發(fā)現(xiàn)了疑似青蟹種間雜交產(chǎn)生的4種不同雜交種[9].此外，馬來西亞學(xué)者還開展了紫螯青蟹、擬穴青蟹和欖綠青蟹的人工交配試驗，獲得了成功[10-11].但到目前為止，還未見擬穴青蟹和鋸緣青蟹種間雜交的研究報道，也未見在人工條件下獲得青蟹雜交子代苗種的報道，本研究首次實現(xiàn)了在人工條件下擬穴青蟹與鋸緣青蟹種間交配并通過人工育苗技術(shù)獲得雜交子一代苗種.

圖2 擬穴青蟹與鋸緣青蟹交配（A）和即將孵化的鋸緣青蟹受精卵（B）

2.2 青蟹雜交子一代苗種培育

本研究發(fā)現(xiàn)，受孕的鋸緣青蟹母本卵巢能夠發(fā)育成熟并順利產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后再經(jīng)過15 d的強化培育后，在未進行交配的情況下能夠第二次產(chǎn)卵并孵化出蚤狀幼體，這說明青蟹交配一次后，精液可保存在雌蟹體內(nèi)較長時間，并能夠多次使用.而雌蟹在完成胚胎孵化后其卵巢可快速啟動第二次發(fā)育并能夠再次產(chǎn)卵并孵出幼體，這一發(fā)現(xiàn)夯實并拓展了青蟹繁殖生物學(xué)的內(nèi)涵，為深入理解精液功能和卵巢發(fā)育機理提供了新思路，并為生產(chǎn)上充分利用受孕雌蟹培育人工苗種提供了實踐指導(dǎo).本研究中，鋸緣青蟹雌蟹前后兩次孵化出的蚤狀幼體均在100萬只左右，幼體數(shù)量大于相同規(guī)格擬穴青蟹的產(chǎn)幼數(shù)量，幼體體型也略大于同期的擬穴青蟹幼體，且幼體也相對更活躍.在幼體培育過程中，本研究適當加大了培育池中的溶氧量、餌料投喂量和換水頻率，同時在蚤狀幼體V期時對幼體進行分池培育，以保證幼體生長發(fā)育需求和成活率.

2.3 青蟹雜交子一代表型特征

采用掃描電鏡對雜交子一代和擬穴青蟹的5個蚤狀幼體期及大眼幼體期個體進行了表型特征鑒定，結(jié)果僅在蚤狀幼體I期和大眼幼體的尾部發(fā)現(xiàn)剛毛數(shù)量存在一定的差異，未發(fā)現(xiàn)雜交子一代幼體與同期擬穴青蟹幼體之間存在明顯差異（圖3）.

圖3 青蟹雜交子一代幼體與擬穴青蟹幼體的表型特征對比

采用普通光學(xué)顯微鏡對仔蟹I期個體進行觀察鑒定，同時采用肉眼觀察的方法對仔蟹II期、III期、VI期和VII期個體進行觀察鑒定（圖4）.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交子一代個體中存在少量的畸形個體，即雙側(cè)眼柄從眼窩中移位至前額，眼柄間距縮短.同時，在雜交子一代仔蟹II期和III期個體的步足上存在數(shù)個深顏色斑點，而在擬穴青蟹同期仔蟹中未發(fā)現(xiàn)這一特點.這些斑點隨著發(fā)育的進行逐漸消失，VI期和VII期仔蟹與擬穴青蟹同期個體相比沒有明顯差異.此外，還發(fā)現(xiàn)雜交子一代個體比同期擬穴青蟹個體在體型和體重方面具有一定的優(yōu)勢，這可能與雜種優(yōu)勢有關(guān).

圖4 青蟹雜交子一代仔蟹期的表型特征

2.4 親緣關(guān)系分析

通過對線粒體COI序列的擴增、測序和序列拼接等分析，最終獲得的高質(zhì)量序列長度為767 bp.序列比對分析表明，雜交子一代個體的COI序列與母本鋸緣青蟹完全一致，而與父本擬穴青蟹之間存在差異，這表明雜交子一代個體的線粒體來源于母本鋸緣青蟹，而非來自父本擬穴青蟹，從而證實它們是真正的雜交產(chǎn)生的后代.重建的系統(tǒng)進化樹表明，它們與鋸緣青蟹同屬一個分支，而與擬穴青蟹位于不同的分支，這再次證明它們的線粒體來源于母本鋸緣青蟹而非父本擬穴青蟹，這與線粒體的母性遺傳特征完全吻合.線粒體的這一遺傳特性還被用來進行物種鑒定，如：Ma等利用線粒體序列建立了鑒定青蟹屬4個物種的技術(shù)，還建立了基于PCR技術(shù)的快速鑒定方法[15].

3 結(jié)論

本研究首次在人工條件下建立了擬穴青蟹和鋸緣青蟹的種間雜交技術(shù)，通過室內(nèi)人工育苗技術(shù)獲得了雜交子一代苗種.表型鑒定未發(fā)現(xiàn)雜交子一代個體與擬穴青蟹間存在明顯差異（極少數(shù)個體存在眼柄移位現(xiàn)象），遺傳分析表明雜交子一代個體線粒體來自母本鋸緣青蟹而非父本擬穴青蟹.該研究表明開展青蟹種間雜交從而培育雜交新品種具有一定的可行性.本研究為大規(guī)模開展青蟹種間雜交創(chuàng)新研究奠定了理論和技術(shù)支撐.

圖5 雜交子一代個體、父本、母本的進化分析