余麗 宋露

（保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000）

芳香植物用作香料的歷史悠久，2 000年前就有大量文獻(xiàn)[1?2]記載了用芳香植物制作香料的歷史，如用于制作香燭、防腐劑、香精、香水、化妝品、藥品、食品和飲料的調(diào)味料以及抗氧化劑等[3?4]。由于芳香植物精油具有抑菌效果、抗氧化性和對(duì)生物的趨避性等天然特性，近些年以來(lái)，很多芳香植物成了較為熱門的研究領(lǐng)域。

木姜子(Litsea pungensHemsl.)屬樟科，木姜子屬，落葉小喬木木姜子種，別名山胡椒、山蒼子，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)為中藥材及木姜子精油提取應(yīng)用[5?7]。木姜子性味辛、微苦，無(wú)毒，枝、葉均具有芳香味，根皮及葉可供藥用，可作為中藥材，有溫中行氣，止痛燥濕，健脾消食，解毒消腫的作用。目前對(duì)木姜子屬植物的揮發(fā)油成分及生物活性的研究較多[8?10]，其主要成分有醛類和醇類，其中檸檬醛含量豐富(15.89%)，所散發(fā)的檸檬香氣是重要的香料，具有平喘和抗菌功效[11?12]，同時(shí)也是合成紫羅蘭酮的主要原料。但關(guān)于木姜子精油提取工藝的研究不多，本研究采用正交法優(yōu)化了水蒸氣蒸餾法提取木姜子果實(shí)中精油的條件，并研究了該木姜子精油的抑菌效果，為木姜子資源開(kāi)發(fā)及木姜子精油的利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

木姜子：購(gòu)買產(chǎn)自四川自貢的木姜子干果；

大腸桿菌（Eccherichia coli），金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aurens)，銅綠假單胞菌(Pseudomo?nas alcaligebes)，黑曲霉(Aspergillus niger)，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，由保山學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平、無(wú)菌操作臺(tái)、粉碎機(jī)、微量移液管等。

1.3 試劑和培養(yǎng)基

試劑：氯化鈉，吐溫80。

培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。

1.4 方法

1.4.1 水蒸氣蒸餾法提取精油

將木姜子果實(shí)用破壁機(jī)打碎進(jìn)行避光儲(chǔ)存，稱取25 g木姜子，按照一定料液比加入一定量的氯化鈉，浸泡一定的時(shí)間后利用水蒸氣蒸餾法[13?14]進(jìn)行精油提取，將提取出的木姜子精油置于棕色瓶中放入4℃冰箱中儲(chǔ)藏。根據(jù)公式計(jì)算精油提取率[14?17]。

V：木姜子精油提取體積

M：木姜子質(zhì)量

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取木姜子25.0 g，選擇浸泡時(shí)間（0 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、料液比（1︰15、1︰20、1︰25、1︰30、1︰35）、提取時(shí)間（1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h）、NaCl濃度(0 g/L、15 g/L、30 g/L、45 g/L、60 g/L)4個(gè)因素，在某一單因素為變量的條件下（固定因素分別取料液比1：25，浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L，提取時(shí)間2.5 h）進(jìn)行精油提取，計(jì)算精油得率?？疾旄饕蛩貙?duì)木姜子精油得率的影響，用于確定提取精油條件的最佳范圍。

1.4.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、氯化鈉（D）四個(gè)因素通過(guò)L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)各因素水平及試驗(yàn)方案見(jiàn)表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案

1.4.4 木姜子精油的抑菌活性

采用倍比稀釋法探討木姜子精油對(duì)不同菌種的最小抑菌濃度（MIC）。具體操作為：首先將木姜子精油分別配制成濃度為0.125%、0.250%、0.500%、1.000%、2.000%的溶液，取各濃度溶液1 mL分別與15 mLPDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基混合制成含不同濃度木姜子精油的平板培養(yǎng)基。其次取已調(diào)至合適濃度（細(xì)菌、酵母菌濃度為108cfu/mL,霉菌孢子濃度調(diào)成105cfu/mL）的5種待測(cè)菌懸液各200 μL均勻涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基中（細(xì)菌為NA，酵母菌、霉菌為PDA），每個(gè)濃度做3組重復(fù)。最后細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24 h，酵母菌、霉菌在28℃下培養(yǎng)48 h～72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，將平板中完全不出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的最低濃度作為提取液的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)木姜子精油提取的影響

由圖1可知，在取料液比1：25，NaCl濃度30 g/L，提取時(shí)間2.5 h條件下，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，精油提取的量逐漸增加；當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到3.0 h時(shí)，木姜子精油的提取量最大，之后隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，木姜子精油提取的量逐漸下降。這是因?yàn)樵诮?.0 h后已經(jīng)達(dá)到飽和，隨著時(shí)間延長(zhǎng)也不能再吸收水分，同時(shí)水分過(guò)多也會(huì)增加精油收集的難度。由圖1可知，精油提取的合適浸泡時(shí)間在2.0 h～4.0 h之間。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)木姜子精油提取的影響

2.1.2 料液比對(duì)木姜子精油提取量的影響。

由圖2可知，在浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L，提取時(shí)間2.5 h條件下，隨著料液比的增加，木姜子精油的提取量逐漸增加；當(dāng)料液比為1︰25時(shí)，木姜子精油提取量達(dá)到最高；之后隨著料液比的增加木姜子精油的提取量逐漸下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)料液比小時(shí)水分分散不徹底影響出油率，料液比大時(shí)溶于水中的精油較多影響精油收集使精油得率降低。綜合多方面考慮，確定合適的料液比范圍為1︰20～1︰30之間。

圖2 料液比對(duì)木姜子精油提取量的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)木姜子精油的影響。

由圖3可知，在料液比1：25，浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L條件下，隨著提取時(shí)間的增加，木姜子精油的提取量增加；當(dāng)提取時(shí)間為3.0 h，木姜子精油的提取量達(dá)到最高；之后隨著提取時(shí)間的增加木姜子精油的提取量逐漸下降。這是因?yàn)樘崛?.0 h后，精油已基本被蒸餾出來(lái)，再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加精油得率，同時(shí)精油是一種易揮發(fā)物質(zhì)，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)使精油揮發(fā)導(dǎo)致精油損失。綜合提取效率、提取成本等多方面因素，確定精油合適的提取時(shí)間范圍為2.0 h～3.0 h之間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)木姜子精油的影響

2.1.4 NaCl濃度對(duì)木姜子提取量的影響。

在精油提取中加入氯化鈉是為了加速油水混合物分層，同時(shí)鹽析作用也可降低精油在水中的溶解度，便于精油收集增加提取率。隨著濃度增加鹽析效果反而減弱，精油得率下降。由圖4可知，在料液比1：25，浸泡3 h，提取時(shí)間2.5 h條件下，隨著氯化鈉濃度的增加，木姜子精油的提取量逐漸增加；當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，木姜子精油的提取量達(dá)到最大；之后隨著氯化鈉濃度的增加，木姜子精油的提取量逐漸下降。綜合考慮，確定氯化鈉濃度合適范圍為15 g/L～45 g/L之間。

圖4 NaCl濃度對(duì)木姜子提取量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定木姜子精油提取各因素的合適范圍，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 木姜子精油提取水平設(shè)計(jì)

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，各因素對(duì)木姜子精油提取的影響順序?yàn)镈＞C＞A＞B,即氯化鈉濃度的變化對(duì)木姜子影響最大，其次是料液比，再然后是浸泡時(shí)間，最后是提取時(shí)間。最佳參數(shù)組合為A1B2C2D2或A1B2C3D2,考慮成本因素，本實(shí)驗(yàn)采用A1B2C2D2組合，即木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比為1：25，氯化鈉濃度為30 g/L，在此條件下精油得率為2.01 mL/100g。

2.3 木姜子精油的抑菌活性

由表5可知，抑菌效果隨木姜子精油濃度減小而降低，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25%，對(duì)銅綠假單胞菌的MIC值為2.000%，對(duì)酵母菌、黑曲霉、大腸桿菌的MIC值為0.500%。這說(shuō)明木姜子精油對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用。

表5 MIC值的測(cè)定

3 結(jié)論和討論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出水蒸氣蒸餾法提取木姜子精油的最佳方案是木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比為1：25，氯化鈉濃度為30g/L。此方案提取出的精油品質(zhì)較好，精油得率2.01 mL/100 g。同時(shí)水蒸氣蒸餾法所得精油具有無(wú)有機(jī)溶劑殘留、安全無(wú)毒、可直接使用等特點(diǎn)[13,15]，有利于對(duì)其進(jìn)行深入研究。

木姜子精油對(duì)5種受試菌均有不同程度的抑制作用，最小抑菌濃度的測(cè)定得到各菌種的MIC值：金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25%，銅綠假單胞菌的MIC值為2.000%，酵母菌、黑曲霉、大腸桿菌的MIC值為0.500%，其中金黃色葡萄球菌對(duì)木姜子精油敏感性較強(qiáng)，這個(gè)結(jié)果與項(xiàng)昭保[8]研究結(jié)果比較相似。這說(shuō)明木姜子精油具有很好的抑菌作用和重要的藥用價(jià)值。

木姜子揮發(fā)油成分研究表明[7?12]，揮發(fā)油組成主要包括萜烯類、醛類、醇類和酮類，同時(shí)木姜子不同的部位其揮發(fā)油成分有很大差別[11]。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取木姜子果實(shí)精油，可以為更有效的提取研究和利用木姜子精油提供一定的理論依據(jù)。木姜子精油較好的抑菌性能，也能夠?yàn)樘烊环栏瘎┑拈_(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。