黃年英，朱珍珍，劉昌燕，廖芳麗，李 莉，陳宏偉，劉良軍，韓雪松，萬正煌 ，沙愛華

（1. 長江大學農學院/主要糧食作物產業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；2. 湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所/糧食作物種質創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；3. 荊州市種子管理局，湖北 荊州 434020）

0 引言

【研究意義】綠豆[Vigna radiata（L.）Wilczek]，屬菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna），是我國傳統(tǒng)的豆類食物，廣泛種植于華北、西北和東北等主產區(qū)及其他省份[1]，綠豆播種季節(jié)常因降雨量少而影響綠豆種子萌發(fā)，嚴重限制了綠豆生產的發(fā)展[2,3]。除了引水灌溉，篩選耐旱綠豆種質資源、培育耐旱品種是解決這一問題的根本途徑。萌發(fā)期是植株正常生長發(fā)育的關鍵時期，而土壤水分含量會直接影響種子萌發(fā)，因此萌發(fā)期是研究植物耐旱性的關鍵時期。對綠豆種質資源萌發(fā)期耐旱性進行評價及篩選耐旱種質，可為綠豆耐旱品種選育及品種改良提供參考[4]。【前人研究進展】近年來，綠豆種質篩選方面的研究已有較多報道，劉晨旦等[5]采用15% 的PEG-6000 高滲溶液對 58 份綠豆品種進行干旱模擬脅迫，測定其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、活力指數和相對根長等指標，對不同基因型綠豆品種的耐旱性進行了鑒定，篩選出1份高耐和4份耐性品種。王蘭芬等[6]利用抗旱性系數、隸屬函數和抗旱性指數對綠豆的抗旱性進行評價，指出3種方法相關性極高，適宜于綠豆抗旱鑒定評價。Ali等[7]根據綠豆種子萌發(fā)特性與幼苗抗氧化潛能及養(yǎng)分吸收的關系，研究了不同綠豆品種的耐旱性。高運青等[8]運用灰色關聯(lián)度分析方法，對29份不同來源綠豆種質資源進行綜合評價，篩選出6份綜合性能較好的綠豆品種，并依據聚類分析將其資源聚為4 類?；诜肿泳垲惖姆椒軌驕蚀_揭示不同種質之間的遺傳關系，為應用不同種質開展相關育種提供參考，綠豆中也有較多研究報道。Sunayana等[9]對60份不同基因型綠豆在夏季限濕條件下的遺傳差異進行了評價，基于19個表型標記，層次聚類分析確定了9個大類，包含1～15個基因型。葉衛(wèi)軍等[10]開發(fā)了274 2個SSR標記，通過聚類分析將90份材料分為2個類群，具有相同地理來源的材料多數可以聚在一起或成簇狀分布。趙雅楠等[11]利用 15 對SSR引物對東北三省地區(qū) 156 份綠豆種質資源進行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數為 0. 478 的閾值處將參試個體分為 5 個組群，相同地理來源品種大多成簇分布?！颈狙芯壳腥朦c】前人研究雖然鑒定出了一些耐旱綠豆種質，但仍無法滿足生產需求。本研究擬通過評價收集的56份綠豆種質萌發(fā)期耐旱性，期望鑒定出新的耐旱綠豆種質，并明確其遺傳基礎，以滿足綠豆耐旱育種的需要。【擬解決的關鍵問題】以相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對根長等10個指標作為耐旱性評價指標，通過主成分分析、隸屬函數分析和多元分析方法鑒定綠豆種質耐旱性?；赟SR擴增對56份種質資源進行分子聚類，明確其遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的56份綠豆種質材料及來源地如表1所示，均 由湖北省農業(yè)科學院糧食作物科學研究所提供。

1.2 耐旱種質資源篩選試驗設計

1.2.1 試驗準備 選取優(yōu)質、飽滿的種子在10%Naclo溶液中浸泡5 min，然后用無菌水洗滌3～4次。均勻擺入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，甘露醇處理和蒸餾水對照處理（CK）均3次重復，每個重復放25粒種子，用15 mL甘露醇溶液或蒸餾水浸潤，培養(yǎng)皿放置在人工培養(yǎng)箱黑暗發(fā)芽，溫度為25 ℃，每天定時補 充少量溶液或水。

1.2.2 耐旱性相關指標測定 從種子放置培養(yǎng)皿第2天開始每日定時統(tǒng)計發(fā)芽種子數。第8天從每個培養(yǎng)皿中隨機選取10株正常生長的幼苗測定其根長、芽長及其鮮重等指標，并計算平均值。發(fā)芽相關指標按農作物發(fā)芽技術規(guī)定（GB/T 35434 1995）測量計算，各指標公式如下：

相對發(fā)芽率（RGR，relative germination rate）=第8 d發(fā)芽種子數/供試種子數×100%

發(fā)芽率（GR，germination rate）=第8 d發(fā)芽種子數/供試種子數×100%

相對發(fā)芽勢（RGE，relative germination energy）=（處理發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢）×100%

發(fā)芽勢（GE，germination energy）=（第5 d的發(fā)芽種子數/供試種子數）×100%

表 1 56份綠豆材料編號及基本信息Table 1 Codes and basic information of 56 mung bean germplasms

相對根長（RRL，relative Root length）=（處理根長/對照根長）×100%

相對胚軸長（RPL，relative plumular axis length）=（處理胚軸長/對照胚軸長）×100%

相對芽長（RBL，relative bud length）=（處理芽長/對照芽長）×100%

相對芽干重（RSDW，relative shoot dry weight）=（處理芽干重/對照芽干重）×100%

相對芽鮮重（RSFW，relative shoot fresh weight）=（處理芽鮮重/對照芽鮮重）×100%

活力指數（VI，vigor index）=（相對苗高×相對發(fā)芽率）×100%

相對苗高（RBL，relative bud length）=（處理苗高/對照苗高）×100%

萌發(fā)耐旱指數（GDRI，germination drought tolerant index）=滲透脅迫下的萌發(fā)指數/對照萌發(fā)指數，萌發(fā)指數（GI，germination index）=（1.00）nd2+（0.75）nd4+（0.5）nd6+（0.25）nd8（其中，nd2、nd4、nd6、nd8分別為第2、4、6、8 d的種子發(fā)芽率，1.00、0.75、0.50、0.25分別為相應萌發(fā)時間所賦予的耐旱系數）

萌發(fā)脅迫指數（GSI，germination stress index）=處理種子發(fā)芽指數/對照種子發(fā)芽指數

發(fā)芽指數（GI，germination index）=?（DG/DT）（DG為逐日發(fā)芽數，DT為相應DG的發(fā)芽天數）

萌發(fā)耐旱性指數和萌發(fā)脅迫指數的計算方法參照 李玲等[12]的方法。

1.2.3 數據統(tǒng)計分析 采用Microsoft Excel 2010 進行數據統(tǒng)計、計算及隸屬函數分析，DPS 7.01 統(tǒng)計軟件進行數據相關性分析及主成分分析。相關公式如下：

式中，U（Xj）表示j指標的隸屬函數值，Xj為某個指標的實際測量值，Xjmax、Xjmin分別為該指標的最大值和最小值。

權重計算公式：

式中，Pj表示第j個綜合指標的貢獻率。綜合評價D值計算公式：

參考王利彬等[13]的大豆耐旱性鑒定方法，把耐旱級別劃分為5個等級：1級：D≥0.8，高耐；2級：0.6≤D＜0.8，耐；3級：0.4≤D＜0.6，中耐；4級：0.2≤D＜0.4，較敏感；5級：D＜0.2，敏感。

1.3 SSR試驗設計

1.3.1 DNA提取和PCR擴增 取室溫下種植的綠豆新鮮幼葉葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。并將DNA稀釋至50 ng·μL?1，選用34對SSR引物[14]對綠豆進行SSR標記分析（表2）。反應體系總體積為15 μL，包含 Taq聚合酶0. 2 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 0.4 μL，引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，ddH2O 10. 2 μL。PCR擴增在TGreat Gradient

表 2 用于遺傳多樣性分析的34對引物信息Table 2 Thirty-four pairs of primers used for genetic diversity analysis

Thermal Cycler OSE-GP-01型PCR儀上進行。反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，53～60 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10min。PCR產物用6.0% PAGE電泳分析，銀染后讀帶。每個基因座的等位基因數（Na）和多態(tài)性 信息含量（PIC值）均作為多樣性參數[15]。

1.3.2 數據統(tǒng)計分析 同一對SSR引物擴增帶（等位基因變異）在電泳板相同位置有帶記為 1，無帶記為0。使用PowerMarker 3.4計算遺傳多樣性參數。利用NTSYS-PC 2.1軟件生成遺傳相似系數，并進行聚 類分析。

2.1 10%的甘露醇溶液模擬干旱脅迫對綠豆種質耐旱性相關指標的影響

在10%甘露醇溶液和蒸餾水對照下測量56種綠豆種質的發(fā)芽指標（表3）。發(fā)芽勢為4.00%～88.00%，平均值為44.32%，較對照變化率為?54.12%；發(fā)芽率為28.00%～100%，平均為64.74%，變化率為?33.67%；其他發(fā)芽相關指標也表現出受到明顯抑制作用，芽鮮重變化率最大為?99.00%，其次為活力指數變化率為?96.81%，根長、胚軸長、芽長、芽干重、發(fā)芽指數、萌發(fā)指數變化率分別為?93.1%、?92.14%、?95.4%、?96.00%、?73.04%、?70.51%。因此，干旱脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用體現在多個性狀，抑制程度也存在差異。比較處理組與對照組，處理組芽長與芽干重的變異系數分別降低14.29%和2.33%，其發(fā)芽勢變異系數增加9.52倍，胚軸長、萌發(fā)指數、發(fā)芽指數、發(fā)芽率、簡易活力指數、芽鮮重和根長分別增加9.00倍、7.20倍、5.67倍、0.84倍、0.78倍、0.53倍、0.36倍（表3）。

表 3 56份綠豆材料萌發(fā)期蒸餾水和10%甘露醇干旱脅迫下各指標的變化與比較Table 3 Evaluation indicators (mean+SD) on seeds of 56 mung bean germplasms germinated under water or 10% mannitol treatment

2.2 不同綠豆種質資源萌發(fā)期耐旱性評價指標的主成分分析

主成分分析獲得的前三個綜合指標的貢獻率分別為57.87%，16.42%和11.42%，累積貢獻率達85.71 %（表4），表明前3個相互獨立的主成分能夠代表10個指標的變異信息。將其命名為3個全新的相互獨立的綜合指標，順序定義為第 1、第2、第 3主成分（Comprehensive index，CI1、CI2和 CI3）。

2.3 不同綠豆種質資源萌發(fā)期耐旱性的綜合評價

在干旱脅迫處理，CI 1中種質No.3的 隸屬函數值U（Xj）最小，而No.13的 U（Xj）最大（表5）, 表明以 CI 1作為評價指標時，No.3和 No.13分別對干旱表現為敏感和高耐。根據主成分分析得到的各綜合指標貢獻率大小（表4），計算U（X）1、U（X）2和U（X）3的權重值Wj，分別為 0.675、0.192和0.133。進一步根據U（Xj）和相應Wj進行加權計算得到的綜合評價值D對56份種質耐旱性進行評價，發(fā)現No.13 的D值最大，而No.3的 D 值最?。ū?），表明它們分別為最耐旱和最敏感種質。

2.4 耐旱性分類結果

根據各種質資源的綜合評價D值，按耐旱性分級標準將56個綠豆品種分為高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5個等級。其中中綠14號（No.13）和中綠17號（No.16）表現為高耐；10 份種質（No.01，08，18，20，21，22，37，40，48，52）表現為耐旱，占供試材料的17.86%；中耐種質30 份，分別為No.02，04，06，07，09，10，11，14，15，17，19，23，26，28，34，35，36，39，41，42，43，44，45，46，49，50，51，54，55和56，占供試材料的53.58%；敏感材料13份，分別為No.05，12，24，25，27，29，30，31，32，33，38，47和53，占供試材料的23.21%；高敏材料1份，為中綠3號（No.03）。

表 4 主成分分析Table 4 Results of principal component analysis

2.5 遺傳多樣性分析

利用SSR標記研究遺傳多樣性，等位基因數為2～12個，平均等位基因數為5.5個，PIC值的變幅為0.03～0.67，平均值為0.27。34對引物共擴增出191條DNA條帶，得到187條多態(tài)性條帶（等位基因）（表6）?；赟SR聚類將56個種質在D-0.64分為3個主要類群（圖1）。第一類群（Ⅰ）共有25個種質資源（No.01、22、02、11、09、15、17、42、16、34、41、14、18、23、39、05、07、13、36、21、44、24、25、47、48），其中84%為中耐、耐旱和高耐。值得注意的是2個高耐品種（No.13和No.16）聚在相近亞群，而3個敏感種質No. 24，No.25和No.47聚在另外相近亞群。第二類群（Ⅱ）由26個種質組成，其中70%為中耐和耐旱。此外，大部分敏感或高敏種質都聚于相近亞群，例如No.03和No.38在一個小亞群中，No.32、29、33、30、53聚在相近亞群。第三類群（Ⅲ）僅包括2份敏感3份中耐種質。以上結果表明，第一組種質可能較耐旱，具有相似的遺傳基礎。第二組種質遺傳基礎復雜，表現出不同程度的耐旱性，第三組種質可能偏敏感。

表 5 56個綠豆品種的綜合指標、指標權重、隸屬函數和綜合評價（D值）Table 5 Comprehensive indices, index weights, subordinate function, and comprehensive evaluation D value on 56 mung bean germplasms

表 6 34對SSR引物在綠豆中的多態(tài)性Table 6 Polymorphisms of 34 pairs of SSR primers in mung beans

3 討論與結論

甘露醇模擬干旱的試驗方法被廣泛應用于馬鈴薯[16]、狗尾草[17]、玉米[18]、高粱[19]、油菜[20]等作物中。種子發(fā)芽率是衡量種子活力的重要指標之一，但是如果將其作為衡量種子耐旱性的唯一標準，很難全面反映種子萌發(fā)期的耐旱性，因此必須建立一套更加綜合全面的種子萌發(fā)耐旱評價體系。

本文參考其他作物[12，13，18，21，22]耐旱性鑒定方法，在綠豆中建立了一種基于多項綜合指標評價種子萌發(fā)期耐旱性的方法。通過采用這一方法評估56份綠豆種質的萌發(fā)耐旱性，鑒定出2份高耐（中綠14和中綠17）和1份高敏種質（中綠3號），其他種質分別鑒定為耐（17.86%）、中耐（53.38%）和敏感（23.21%）。這56份種質中，劉晨旦等[5]對中綠1號（No.01）、中綠2號（No.02）、中綠10號（No.09）、濰綠5號（No.23）、中綠5號（No.05）、中綠8號（No.07）、晉7（No.44）、中綠3號（No.03）、冀綠2號（No.40）、中綠11號（No.10）、晉8（No.45）、保綠942（No.46）、白綠9號（No.50）和白綠10號（No.51）已做過芽期抗旱性鑒定[5]。與之相比，大部分品種的抗性鑒定一致，表現為中耐和耐。但是其中3個品種的抗性鑒定結果存在差異：中綠3號、中綠5號和中綠10號本文分別鑒定為高敏、敏感和中耐，而劉晨旦等[5]分別鑒定為中抗、中抗和高抗。出現這種偏差的原因可能在于本文用到的干旱模擬劑為甘露醇，而劉晨旦等[5]用的是PEG-6000。另外本文以10個耐旱評價相關指標進行綜合評價，而劉晨旦等[5]只選用了其中的4個指標采用隸屬函數值進行評價。盡管如此，大部分品種2種方法鑒定結果一致，表明2種方法都能比較準確的用于鑒定綠豆芽期耐旱性。

在耐旱性鑒定的基礎上，進一步明確其遺傳基礎，將有利于在育種中有針對性的利用這些種質資源。SSR 標記可以產生足夠多的多態(tài)性條帶以區(qū)分綠豆種質的遺傳多樣性。本研究34對引物中，PIC平均為0.27，最高為0.67（表6），稍低于前人研究結果[11,15]，可能是由于引物數量較少導致。基于SSR的聚類圖將56個種質分為三大類，分別表現出不同的耐旱性（第II類群，圖1）。同時，同一類群中可能在某些位點具有相近的遺傳基礎，但由于其他位點遺傳基礎不同，因而同一類群中的不同種質也有可能表現出不同的耐旱性（第II類群，圖1）。也有可能由于本文用于聚類的SSR引物數量偏少，導致未能將第II類群中種質的遺傳基礎完全分開，因而出現了不同耐旱性的種質聚在同一類群。

圖 1 56份綠豆基于SSR遺傳相似性的聚類圖Fig. 1 Dendrogram of 56 mung bean germplasms clustered by SSR genetic similarity

總之，本文采用綜合指標評價了56份綠豆種質的萌發(fā)期耐旱性，鑒定出2份高耐種質，可以為綠豆耐旱育種提供資源。同時，也可為從分子水平解析綠豆萌發(fā)耐旱機制奠定基礎。