楊云燕，王其炎，彭地緯，潘一帆，高曉梅，宣澤義，陳少梅，鄒彩霞，曹艷紅?，林波?

1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3湖南普菲克生物科技有限公司，長沙 410011

0 引言

【研究意義】犢牛從出生到育成期需要經(jīng)歷由子宮內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)變到外環(huán)境、由被動(dòng)免疫到主動(dòng)免疫、由液體飼料到固體飼料以及由化學(xué)消化到微生物消化的轉(zhuǎn)變，在這些轉(zhuǎn)變過程中都充滿了風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)[1]。犢牛的免疫力來自初乳獲取的母源抗體，主動(dòng)免疫尚未建立，因此對外界不良環(huán)境的抵抗力、適應(yīng)性和調(diào)節(jié)體溫的能力均較差[2]，尤其在0至3周齡極易受到病菌的侵襲而引起胃腸道疾病造成發(fā)育受阻[3-5]。植物精油具有天然、多功能、無抗藥性等性質(zhì)逐漸成為理想的生長促進(jìn)劑，開發(fā)新型綠色、安全、高效并減少犢牛腹瀉的無抗飼料添加劑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】美國國家動(dòng)物健康監(jiān)測系統(tǒng)（NAHMS）數(shù)據(jù)表明，10%的犢牛死亡和超過50%犢牛發(fā)病均與腹瀉有關(guān)，24%的犢牛在出生后第一個(gè)月都有腹瀉情況，斷奶后犢牛因腹瀉死亡率達(dá)1.8%—2.4%。肉桂醛是一種具有芳香味的抗細(xì)菌、真菌及球蟲等微生物活性的醛類有機(jī)化合物[6-10]，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)還具有抗氧化、刺激內(nèi)源消化酶分泌及調(diào)控腸道微生態(tài)等功能[11]。肉桂醛作為一種高效抗菌物質(zhì)，在幼齡單胃動(dòng)物抗腹瀉及成年反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控中發(fā)揮了良好作用，然而在幼齡反芻動(dòng)物抗腹瀉及瘤胃發(fā)酵調(diào)控中尚未研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前抗生素在犢牛腹瀉預(yù)防和治療中有較好的臨床效果，然而抗生素容易產(chǎn)生犢牛抵抗力損傷及病原菌耐藥性等問題，傳統(tǒng)犢牛培育過程中添加適當(dāng)抗生素預(yù)防犢牛腹瀉是當(dāng)下維持犢牛健康的常用方法，但在動(dòng)物生產(chǎn)中使用抗生素對犢牛機(jī)體本身生長發(fā)育及抵抗外界自身的免疫所帶來的負(fù)面影響將直接影響犢牛未來的發(fā)展[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在研究開食料中添加肉桂醛對哺乳期以及斷奶后犢牛采食、生長性能、健康情況和瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的影響，為肉桂醛在犢牛培育中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)自2018年8—10月在南寧市江南區(qū)犢牛試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)選用出生平均15日齡、體重相接近、健康狀況良好的荷斯坦公犢牛24頭，采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)分為2個(gè)組，試驗(yàn)組和對照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭牛。本試驗(yàn)組與對照組采用相同全脂奶粉和犢牛開食料，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)開食料中添加 0.3%的包被肉桂醛，其中肉桂醛含率為15%，包被壁材為氫化植物油，包被工藝為冷卻噴霧法，由湖南普菲克生物科技有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)期84 d，預(yù)飼期6 d，正試期包括27 d哺乳期及51 d斷奶飼養(yǎng)期。

1.2 試驗(yàn)飼糧和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始每天8：30和17：00飼喂2次還原奶（全脂奶粉按1:7與水混合），飼喂量為：預(yù)飼期6天，8L/（頭·d）；正試期第 1周，6L/（頭·d）；第 2—3周，4L/（頭·d），第4周，2L/（頭·d），試驗(yàn)期第33天斷奶。正試期開始后即添加開食料和燕麥草，分開放置，自由采食，自由飲水。開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 開食料基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（%，風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrition level of base diets for starters feed (%,air dry basis)

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能指標(biāo)測定 本試驗(yàn)正試期開始每天記錄犢牛還原奶和開食料采食量，每隔 3d換料一次。分別于正試期第0天、第27天和第79天對犢牛晨飼前空腹逐一進(jìn)行稱重，記錄犢牛初始重、斷奶日體重和末重，計(jì)算哺乳期、斷奶后和試驗(yàn)全期的干物質(zhì)采食量（DMI）、平均日增重（ADG）、并計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化比（F/G）。

1.3.2 體尺指標(biāo)測定 本試驗(yàn)于正試期第 0天、27天和第 79天晨飼前空腹對犢牛使用測杖和卷尺逐一進(jìn)行體尺測量，測量指標(biāo)包括體高、體長、體斜長、胸圍和管圍，測量方法參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.3.3 腹瀉率和糞便評分 本試驗(yàn)于正試期開始7—14、14—21 和 21—28 d 以及斷奶后 7—14 d、14—21 d、21—28 d和28—35 d每天早晨觀察犢牛飼喂前后1 h試驗(yàn)牛的排便情況，根據(jù)Wisconsin大學(xué)犢牛健康評分表[14]的5分制糞便評分方法對犢牛糞便進(jìn)行評分，評分≥3分的記為一次腹瀉。

1.3.4 瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的測定 本試驗(yàn)分別在正試期第39天和第78天，隨機(jī)挑選試驗(yàn)組與對照組各7頭犢牛，每個(gè)重復(fù)分別選取“2，2，3”頭，晨飼前空腹通過胃管從口腔真空抽取瘤胃液，先棄去開始抽出來的50mL，隨后抽取200mL瘤胃液，分2份樣品裝，每份分裝在2個(gè)50mL的離心管中，一份置于-80℃冰箱保存用于測定瘤胃細(xì)菌區(qū)系，另一份置于-20℃冰箱采用氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸（VFA），具體測定方法參考文獻(xiàn)[15]方法。

1.3.5 瘤胃細(xì)菌區(qū)系的測定 瘤胃液樣本送成都生命基線科技有限公司進(jìn)行基于Miseq PE300平臺(tái)瘤胃微生物菌群組成分析，采用珠磨法從瘤胃液樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的細(xì)菌通用引物擴(kuò)增瘤胃菌群16SrDNA的V3+V4，通用引物為：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），測序數(shù)據(jù)分析采用 QIIME 1.5 進(jìn)行，經(jīng)過去除接頭污染、低復(fù)雜度以及低質(zhì)量 reads 等質(zhì)量控制后，對獲得的序列（clean reads）進(jìn)行拼接并去除引物，用于后繼分析。序列分類操作單元（OTU）注釋和聚類分析按照 97% 相似度進(jìn)行。OTU 聚類分析和注釋通過與Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌序列比對進(jìn)行，細(xì)菌聚類分析到門和屬水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng) WPS表格初步整理后，采用 IMB SPSS Statistics19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)顯著性分析，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 肉桂醛對奶公犢日增重、干物質(zhì)采食量和料重比的影響

由表2可知，試驗(yàn)組的初始體重、末重、平均日增重、干物質(zhì)采食量、料重比與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)全期，試驗(yàn)組與對照組各指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。在哺乳期階段日增重方面，試驗(yàn)組日增重為 0.39kg·d-1，對照組日增重為0.46kg·d-1，對照組較試驗(yàn)組高13.2%；在開食料干物質(zhì)采食量中，試驗(yàn)組較對照組低 9.09%，在飼料轉(zhuǎn)化比方面，試驗(yàn)組較對照組低 6.98%；斷奶后試驗(yàn)組日增重為 0.95kg·d-1，對照組日增重為1.01kg·d-1，對照組日增重高于試驗(yàn)組7.2%，試驗(yàn)組開食料干物質(zhì)采食量較對照組提高了10.0%。

表2 肉桂醛對奶公犢日增重、干物質(zhì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化比的影響Table 2 Effects of cinnamaldehyde on daily gain, dry matter intake and feed efficiency of dairy calves

2.2 肉桂醛對奶牛公犢體尺增長量的影響

由表3可見，在試驗(yàn)組與對照組體尺指標(biāo)中，各階段對照組體尺指標(biāo)略高于試驗(yàn)組，然而，兩組試驗(yàn)犢牛在試驗(yàn)初與斷奶后的體尺指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)?zāi)?，除試?yàn)組體長顯著低于對照組外（P＜0.05），其他各體尺指標(biāo)在均差異不顯著（P＞0.05）。

表3 肉桂醛對奶公犢各階段體尺增長情況的影響Table 3 Effect of cinnamaldehyde on body size growth of dairy calves

2.3 肉桂醛對奶公犢腹瀉率、糞便評分的影響

由表4可知在哺乳期，試驗(yàn)組犢牛在3周內(nèi)的腹瀉率均低于對照組；斷奶后第一周，試驗(yàn)組腹瀉率為7.69%，高于對照組的 4.74%（P＞0.05）；試驗(yàn)組在斷奶后2—4周的腹瀉率逐漸降低，且均低于對照組；然而整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組腹瀉率雖低于對照組，兩組間腹瀉率差異不顯著（P＞0.05）；在犢牛糞便評分方面，試驗(yàn)組犢牛在哺乳期第2周和斷奶后第4周的糞便評分顯著低于對照組（P＜0.01），其余各周有低于對照組的趨勢，但與對照組無顯著差異。

表4 肉桂醛對奶公犢腹瀉率（%）和糞便評分的影響Table 4 Effects of cinnamaldehyde on diarrhea rate (%) and feces score in dairy calves

2.4 肉桂醛對奶公犢瘤胃揮發(fā)性脂肪酸組成及細(xì)菌區(qū)系的影響

由表5可知在斷奶后初期，試驗(yàn)組各揮發(fā)性脂肪酸的含量均低于對照組，各指標(biāo)差異不顯著（P＜0.05）；在試驗(yàn)?zāi)┢?，試?yàn)組在乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。由表6可知，試驗(yàn)組瘤胃菌群的香農(nóng)指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.01），而辛普森指數(shù)和 Chao1指數(shù)均低于對照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組與對照組瘤胃細(xì)菌在門水平的豐度存在差異，對照組中的主要優(yōu)勢菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），試驗(yàn)組中的主要優(yōu)勢菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），對照組中的擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.05），而試驗(yàn)組中的藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria，P＜0.05）、厚壁菌門和放線菌門豐度顯著高于對照組（P＞0.05）。試驗(yàn)組與對照組瘤胃細(xì)菌在屬水平的各菌群豐度差異不顯著（P＞0.05），但試驗(yàn)組普雷沃氏菌屬（Prevotella）高于對照組。

表5 肉桂醛對奶公犢瘤胃揮發(fā)性脂肪酸組成的影響Table 5 Effect of Cinnamaldehyde on rumen fermentation of dairy calves（mmol·L-1）

表6 肉桂醛對奶公犢瘤胃細(xì)菌門水平和屬水平主要菌群組成的影響Table 6 Effect of Cinnamaldehyde on rumen bacteria community at both Phylum and genus levels of dairy calves (%)

3 討論

3.1 肉桂醛對奶公犢生長性能的影響

本試驗(yàn)根據(jù)干物質(zhì)采食量進(jìn)行階段性斷奶，試驗(yàn)全期，試驗(yàn)組與對照組犢牛生長各指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05），然而肉桂醛對斷奶后奶公犢采食量有提高的趨勢，但并未提高日增重，降低飼料轉(zhuǎn)化比表明肉桂醛可能降低了試驗(yàn)組飼料消化率。此外，試驗(yàn)組在試驗(yàn)?zāi)┑捏w長顯著低于對照組，而體高、體斜長、胸圍和管圍等指標(biāo)在斷奶日和試驗(yàn)結(jié)束日均略低于對照組，表明 0.3%肉桂醛添加影響了犢牛體尺發(fā)育。MORIEL[16]等在犢牛斷奶后日糧中添加肉桂醛的試驗(yàn)中表明肉桂醛對犢牛生長沒有顯著影響，其結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。有研究報(bào)道，添加肉桂醛對生長育肥牛的日增重和飼料效率的影響很小[17]，但在日糧中添加肉桂醛會(huì)有提高生長育肥牛干物質(zhì)采食量的效果，其效果與添加量呈正相關(guān)。然而以上研究均是以肉桂醛的形式之間添加，而對包埋形式下的肉桂醛研究還比較少，本研究以氫化植物油為壁材，采用冷卻噴霧法制作了含油率為15%的包被肉桂醛，因此本研究中0.3%的包埋肉桂油相當(dāng)于在開食料中添加了 0.45—1.5g/頭/d的添加量，相比其它成年牛試驗(yàn)中0.5—1g/頭/d的添加水平為目前報(bào)道的最高添加水平，結(jié)果表明 0.3%的添加量在數(shù)值上有提高犢牛開食料采食量的趨勢，但對生長速度有不良的影響，因此是否存在既可提供犢牛開食料采食量又可提高犢牛增重速度的適宜添加量尚有待研究。

3.2 肉桂醛對奶公犢腹瀉率和糞便評分的影響

犢牛出生后面臨外界充滿各種病原體的新環(huán)境后，胃腸道的不成熟使新生犢牛容易發(fā)生腹瀉，通過犢牛腹瀉情況和糞便評分可以有效地了解犢牛營養(yǎng)情況和健康狀況[18]，肉桂醛作為肉桂精油的主要成分，具有防腐殺菌、抗病毒、增強(qiáng)胃腸道蠕動(dòng)的功能，特別是對引起動(dòng)物腹瀉的病菌諸如致病性大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌以及球蟲等均有較強(qiáng)的殺滅作用，是目前發(fā)現(xiàn)抑菌活性最強(qiáng)的精油活性成分之一[19-20]。以前較多的研究主要集中在應(yīng)用肉桂醛來調(diào)控瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃丙酸比例并降低甲烷產(chǎn)生方面，而對肉桂醛防腹瀉的研究還較少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉桂醛組奶公犢腹瀉率與對照組雖然差異不顯著，但是除斷奶后7—14 d外，試驗(yàn)組的腹瀉率均低于對照組，表明肉桂醛有降低腹瀉率的趨勢。斷奶后7—14 d肉桂醛組腹瀉率升高的原因可能與初期肉桂醛大量攝入可能抑制了瘤胃微生物，導(dǎo)致養(yǎng)分進(jìn)入后腸道不完全消化有關(guān)，而隨著時(shí)間的延長，瘤胃微生物區(qū)系對肉桂醛產(chǎn)生了適應(yīng)性，進(jìn)而腹瀉率逐漸降低[21]。周明[10]等研究表明在飼糧中添加600 mg·kg-1肉桂醛制劑可替代抗生素金霉素和桿菌肽鋅，預(yù)防和控制保育豬的腹瀉，提高飼料轉(zhuǎn)化率。然而，目前尚未報(bào)道犢牛開食料中添加肉桂醛對犢牛腹瀉影響的研究，本研究添加的肉桂醛經(jīng)氫化植物油包被，而有研究表明氫化植物油包埋芯材后具有較好的過瘤胃效率[22]。因此，本研究中的包埋肉桂醛避免了肉桂醛的揮發(fā)性氣味對犢牛采食影響，同時(shí)減少了肉桂醛在瘤胃內(nèi)對瘤胃微生物的抑制作用。本研究在開食料中添加了相當(dāng)于0.45—1.5g/頭/d的高量肉桂醛對試驗(yàn)組犢牛腹瀉的抑制作用不明顯，進(jìn)一步表明母源抗體水平對犢牛腹瀉抑制的重要性[23]

3.3 肉桂醛對奶公犢瘤胃發(fā)酵和細(xì)菌區(qū)系的影響

犢牛瘤胃微生物區(qū)系隨著日糧和犢牛健康狀況而改變，肉桂醛對犢牛瘤胃發(fā)酵作用源自肉桂醛通過抑制選定的瘤胃微生物來改變瘤胃發(fā)酵，從而提高動(dòng)物的生長性能和飼料效率。本試驗(yàn)犢牛開食料添加0.3%的氫化植物油包被肉桂醛后，斷奶日試驗(yàn)組瘤胃各揮發(fā)性脂肪酸的濃度低于對照組，但差異不顯著，這與兩組在哺乳期間干物質(zhì)采食量無差異有關(guān)，也與哺乳期間二者均主要以牛奶為主要養(yǎng)分來源，開食料為輔助養(yǎng)分來源有關(guān)。此外，本結(jié)果與CHAVES[24]等報(bào)道在飼料中添加200 mg·kg-1肉桂醛對羔羊瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸沒有影響一致，李艷玲[25]等通過體外產(chǎn)氣試驗(yàn)研究不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度（50、100、200和400 mg·L-1）的肉桂醛對體外發(fā)酵液總VFA濃度也沒有顯著影響。然而，在本試驗(yàn)?zāi)┢?，試?yàn)組在乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均極顯著高于對照組，表明本研究添加的包被肉桂醛雖具有過瘤胃能力，但也可能有少量在瘤胃內(nèi)釋放，進(jìn)而影響了瘤胃微生物區(qū)系。較多研究表明，肉桂醛的對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響與其添加濃度有關(guān)，體外條件下，高濃度肉桂醛會(huì)抑制瘤胃發(fā)酵，降低揮發(fā)性脂肪酸濃度，適宜的濃度則有提高丙酸濃度，從而調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式的功能[26-28]，本研究中犢牛每天攝入約0.45—1.5g/頭/d的包埋肉桂醛組，雖然濃度較高，但也提高了斷奶后期犢牛瘤胃丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度，降低了乙酸/丙酸比例，起到了較好的瘤胃發(fā)酵調(diào)控作用，表明包被降低了肉桂醛在瘤胃中釋放，而少量釋放的肉桂醛對瘤胃發(fā)酵的調(diào)控起到了積極作用[29]。

揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃微生物的發(fā)酵終產(chǎn)物，本研究中瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度和組成的變化表明添加肉桂醛影響了瘤胃微生物區(qū)系組成，特別是肉桂醛組提高了瘤胃菌群的香農(nóng)指數(shù)，降低了辛普森指數(shù)表明肉桂醛提高了瘤胃菌群的多樣性，有研究表明消化道微生態(tài)的多樣性是維持消化道健康的基礎(chǔ)，因此肉桂醛可能對瘤胃微生態(tài)區(qū)系起到了良好的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，開食料添加肉桂醛，在門水平上降低了擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度，提高了厚壁菌門（Firmicutes），特別是放線菌門（Actinobacteria，20.15% vs 7.3%）的豐度，但僅在屬水平上有提高普雷沃氏菌屬（Prevotella）菌群的趨勢。放線菌（Actinobacteria）是一類革蘭氏陽性細(xì)菌，該菌群在肉桂醛添加組豐度的提高與瘤胃丙酸濃度的升高趨勢一致，表明該菌群可能與肉桂醛組的丙酸生成高度相關(guān)。肉桂醛組Firmicutes和Prevotella豐度的增加可能與肉桂醛組揮發(fā)性脂肪酸濃度增加有關(guān)，較多研究表明消化道內(nèi)高豐度的 Firmicutes有利于碳水化合物的高效消化分解[30]；此外，普雷沃氏菌屬是瘤胃內(nèi)的多功能菌群，在淀粉、蛋白和纖維降解中均發(fā)揮了重要作用[31]，因此該兩類菌群豐度的增加可能對維持肉桂醛組瘤胃內(nèi)高濃度揮發(fā)性脂肪酸具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究在犢牛開食料中添加 0.3%含油率 15%的包被肉桂醛后，在哺乳期和斷奶后肉桂醛對犢牛日增重、干物質(zhì)采食量和料重比方面沒有顯著影響，肉桂醛降低了哺乳期犢牛腹瀉率，顯著提高了斷奶后犢牛瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度，同時(shí)提高瘤胃菌群多樣性。本研究在開食料中犢牛攝入量肉桂醛（0.45—1.5g/頭/d），雖降低了腹瀉率并改變了瘤胃發(fā)酵模式，但影響了日增重，因此最優(yōu)添加濃度尚有待進(jìn)一步研究。