喬中全，王曉明，曾慧杰，劉思思，蔡 能，彭繼慶，黃益智，李永欣

（1.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林下特色生物資源培育與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；3.中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術(shù)學院，湖南 長沙 410004）

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand-Mazz為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬Lonicera植物，是中藥材山銀花的主要來源植物之一，具有清熱解毒、疏散風熱功能，用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。根據(jù)功能成分、藥理藥效等方面的研究，灰氈毛忍冬的主要活性成分是綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）[2-3]，且含量較高，是綠原酸提取的主要原料[4-5]，已應用于制藥、保健品和化妝品等，市場開發(fā)潛力大。灰氈毛忍冬的綠原酸含量與生物合成途徑相關(guān)基因的表達量關(guān)系緊密，隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，藥用植物功能基因研究已成為當前的研究熱點。

4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是苯丙烷代謝途徑轉(zhuǎn)向下游分支途徑的最后一個關(guān)鍵酶，以肉桂酸、4-香豆酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸和5-羥基阿魏酸等為底物，生成相應的?；o酶A酯，然后在羥基肉桂酰輔酶奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HQT）的作用下生成綠原酸[6-9]。1987年，研究者第一次在歐芹Petroselinum hortense中克隆出2個4CL基因[10]，之后在多種植物中克隆出4CL基因，其存在于一個含有2～5名成員的基因家族中[11]。目前有研究者已對忍冬Lonicera japonica[12-13]、丹參Salvia miltiorrhiza[14-15]、黃芩Scutellaria baicalensis[16]、三枝九葉草Epimedium sagittatum[17]、圣羅勒Ocimum basilicum[18]、蕓香Ruta graveolens[19]、紅花Carthamus tinctorius[20]、桑葚Morus notabilis[21]、枇杷Eriobotrya japonica[22]、葛根Pueraria lobata[23]、多穗柯Lithocarpus polystachyus[24]等藥用植物進行4CL基因克隆、生物信息學及表達模式分析的研究，但未見灰氈毛忍冬4CL基因研究的有關(guān)報道。4CL基因在活性功能調(diào)控研究方面更多集中在木質(zhì)素的生物合成，在非木質(zhì)素類的中間衍生物方面研究的并不多。鑒于4CL基因在綠原酸合成途徑中的重要性，本研究依據(jù)灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得2個Lm4CL基因，并進行基因結(jié)構(gòu)與表達分析，為深入研究灰氈毛忍冬Lm4CL基因在綠原酸合成途徑中的分子調(diào)控機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供試材料采自湖南省林業(yè)科學院忍冬屬植物種質(zhì)資源圃，經(jīng)湖南省林業(yè)科學院王曉明研究員鑒定為灰氈毛忍冬新品種‘龍花’Lonicera macranthoides‘Longhua’（品種權(quán)號：20180256）。隨機選擇3株生長健壯、無病蟲害的植株，于2019年3月10日采集幼葉和幼莖，4月27日采集成熟葉和主莖（完全木質(zhì)化），5—6月采集早期花（呈棒狀，長0.5～1.0 cm，上部稍膨大，表面綠色）、中期花（呈棒狀，長1.5～2.5 cm，頂部似米粒，表面綠色至黃綠色）、末期花（呈棒狀，長3.0～4.5 cm，頂部膨大，向內(nèi)彎曲，表面黃色至黃白色）（圖1），將采集到的樣品用密封袋封好，迅速置于液氮中速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 灰氈毛忍冬的莖、葉和花Fig.1 Stems,leaves and flowers of L.macranthoides

1.1.2 試劑與儀器

EASYspin Plus多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司；PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase高保真酶、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit克隆用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒、Prime ScriptTMRT reagent Kit定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM-Tli RNaseH Plus熒光定量試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；PUCm-T克隆載體、pCold表達載體，上海生工生物工程有限公司；綠原酸＞98%，中國食品藥品檢定研究院；Veriti梯度PCR儀，美國ABI；Step one熒光定量PCR儀，美國ABI；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 方 法

1.2.1 灰氈毛忍冬總RNA的提取與檢測

按照制造商的說明，使用EASYspin Plus多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，中國）從‘龍花’莖、葉和花中分別提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用Eppendorf生物光度計（德國）測定RNA濃度和純度。

1.2.2 灰氈毛忍冬4CL基因中間片段的克隆

基于灰氈毛忍冬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過KEGG分析，4CL的注釋unigenes共有21個，長度從202 bp到2 344 bp，與擬南芥、粳稻、葡萄的序列相似。剔除未Nr注釋及Nr注釋得分低于100分的unigenes，留下與GenBank中已知4CL基因CDS區(qū)域長度比較一致的unigenes。比較發(fā)現(xiàn)，Unigene18557_All、Unigene18499_All與 已 知 的4CL基因高度同源，并作為核心片段進行后續(xù)分析，根據(jù)其序列設(shè)計引物（表1），并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為：正、反引物各0.6 μL，cDNA模板2 μL，反應液12.5 μL，ddH2O 9.3 μL，總體積25 μL。反應程序：94℃ 5 min，94℃ 45 s，48℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min。用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物觀察，回收產(chǎn)物連接PUCm-T載體，經(jīng)藍白斑篩選、測序。

1.2.3 灰氈毛忍冬4CL基因5′和3′末端RACE的擴增

根據(jù)4CL基因中間片段，設(shè)計末端擴增特異性引物（表1），按照SMARTerTMRACE試劑盒擴增步驟進行。擴增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳分檢測，PCR產(chǎn)物連接pUCm-T載體，經(jīng)藍白斑篩選、測序。

1.2.4 灰氈毛忍冬4CL基因全長CDS的克隆

使用DNAMAN軟件對5′RACE和3′ RACE測序結(jié)果進行序列拼接，獲得4CL基因的全長cDNA，根據(jù)全長序列設(shè)計CDS擴增引物（表1），并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，以cDNA為模板，PCR反應程序為：94℃ 2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer name and sequence

1.2.5 灰氈毛忍冬4CL基因的生物信息學分析

使用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行基因功能注釋，Pfam（https://pfam.xfam.org/search）進行蛋白結(jié)構(gòu)域預測，MEME（ http://meme.nbcr.net/meme/）進行保守基序（Motif）搜索，ClustalW（ http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行多序列比對，Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測，ProtParam（ http://web.expasy.org/protparam/）進行蛋白特性分析，TMHMM2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/servi-ces/TMHMM/）進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預測，SignalP（ http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析，PSORT Prediction（ http://psort1.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位預測，MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[25]。

1.2.6 灰氈毛忍冬4CL基因原核表達載體的構(gòu)建

用Xhol I和Hind III兩種酶對回收后的PCR產(chǎn)物、pCold載體進行雙酶切，將純化后的pCold和PCR產(chǎn)物用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。通過熱激轉(zhuǎn)化的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，在轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物中加入LB液體培養(yǎng)基，37℃、170 r/min震蕩培養(yǎng)45 min，6 000 r/min離心1 min后，倒掉部分上清液，取150 μL涂在含100 μg/mL氨芐固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑選陽性克隆菌斑PCR鑒定后，送至長沙擎科公司測序。

1.2.7 工程菌的制備

提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21 star (DE3)中，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)、過夜，隨機挑選單菌落，進行菌液PCR鑒定。

1.2.8 基因的誘導表達

將陽性工程菌在含有100 μg/mL的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至吸光度達到0.6左右時，加入終濃度分別為0.0、0.4、0.6、0.8 mmol/L的IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。

1.2.9 灰氈毛忍冬4CL基因的表達模式分析及綠原酸含量的檢測

熒光引物（表1）使用在線軟件Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）進行設(shè)計。以18 S為內(nèi)參基因，采用SYBR Green熒光染料法進行基因的相對表達水平分析。正、反引物各0.3 μL，cDNA 1.5 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.9 μL，反應總體積為20 μL。反應程序參照熒光定量試劑盒說明書。

采用高效液相法（HPLC）測定綠原酸含量，參照《中國藥典》2015年版制備樣品溶液，設(shè)定液相條件[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰氈毛忍冬總RNA的提取與檢測

以灰氈毛忍冬葉片為材料提取的總RNA，核酸蛋白檢測儀（Eppendorf）測得A260/A280=1.98、A260/A280=2.22，說明RNA純度高，沒有蛋白、鹽離子等污染；瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2A）顯示，28 S、18 S rRNA條帶清晰，且28 S rRNA條帶亮度大約為18 S rRNA條帶亮度的2倍，表明提取的總RNA完整、無降解。

2.2 灰氈毛忍冬Lm4CL基因全長cDNA的獲得

以灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出2個編碼4-香豆酸：CoA連接酶的Unigene18557_All、Unigene18499_All部分序列。利用RACE技術(shù)，從灰氈毛忍冬葉片中成功擴增出兩個全長cDNAs，分別命名為Lm4CL1、Lm4CL2，序列提交GenBank（登錄號：MN103349、MT123898）（圖2D）。Lm4CL1基因全長為1 960 bp，5′端非編碼區(qū)（UTR）長68 bp，3′端非編碼區(qū)（UTR）長275 bp，ORF（Open Reading Frame）長1 617 bp，編碼538個氨基酸；Lm4CL2基因全長2 133 bp，5′端非編碼區(qū)（UTR）長176 bp，3′端非編碼區(qū)（UTR）長273 bp，ORF長1 683 bp，編碼560個氨基酸。

圖2 灰氈毛忍冬Lm4CLs基因的克隆Fig.2 Cloing of Lm4CLs in L.macranthoides

2.3 灰氈毛忍冬Lm4CL基因生物信息學分析

2.3.1 灰氈毛忍冬Lm4CL基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

ProtParam分析結(jié)果（表2）表明，Lm4CL1蛋白的分子質(zhì)量約為58 736.29，等電點（pI）為5.73，總原子個數(shù)為8 317，分子式為C2635H4200N680O771S31，帶正電殘基（Arg+Lys）個數(shù)為55，帶負電殘基（Asp+Glu）個數(shù)為63，脂肪系數(shù)為94.24，不穩(wěn)定系數(shù)為40.84＞40，推測該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為0.056；Lm4CL2蛋白的分子質(zhì)量約為60 387.24，等電點（pI）為8.15，總原子個數(shù)為8 550，分子式為C2690H4306N718O817S19，帶正電殘基（Arg+Lys）個數(shù)為54，帶負電殘基（Asp+Glu）個數(shù)為52，脂肪系數(shù)為92.3，不穩(wěn)定系數(shù)為30.95＜40，推測該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.003。且ProtScale分析表明，Lm4CL1疏水性氨基酸分布大于親水性氨基酸，Lm4CL2疏水性氨基酸分布小于親水性氨基酸，推測Lm4CL1為疏水性蛋白，Lm4CL2為親水性蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)預測顯示，Lm4CL1沒有跨膜結(jié)構(gòu)，Lm4CL2在氨基酸位點的前100和200～300有兩個跨膜區(qū)域；信號肽位點預測顯示，Lm4CL1和Lm4CL2均不存在信號肽位點；亞細胞定位顯示，Lm4CL1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Lm4CL2定位于葉綠體類囊體。

表2 灰氈毛忍冬Lm4CL1蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of Lm4CL1 in L.macranthoides

2.3.2 灰氈毛忍冬Lm4CLs蛋白同源性及系統(tǒng)進化分析

以擬南芥（At4CL1_AAA82888，At4CL2_AAD47193，At4CL3_AAD47195）、毛白楊（Pto4CL1_AAL02145，Pto4CL2_AFC89538）、大豆（Gm4CL1_AAL98709，Gm4CL2_AAC97600）、煙草（Nt4CL2_AAB18638.1）等蛋白的氨基酸序列為參考，使用DNAMAN軟件進行序列比對，總相似性達到69.62%，灰氈毛忍冬Lm4CL1與Lm4CL2蛋白的相似性為35.15%，Lm4CL1、Lm4CL2蛋白與煙草Nt4CL2蛋白的相似性分別為83.58%、39.27%。Lm4CL1、Lm4CL2蛋白都含有3個保守的催化殘基，分別是催化硫酯合成反應的Lys-441和Gln-446及催化半腺苷化反應的Lys-526（圖3，保守催化殘基用黑色三角形表示，相對于Nt4CL2蛋白中氨基酸的位置）。與底物結(jié)合的區(qū)域位于SSGTTGLPKGV（Box I）和GEICIRG（Box II）這兩個AMP結(jié)合位點中間，在Lm4CL2蛋白中兩個位點分別被SSGTTGASKGV和GEIWLRG取代。

圖3 灰氈毛忍冬與其它物種的4CL蛋白序列比對Fig.3 Alignment of Lm4CLs with others

為了研究灰氈毛忍冬Lm4CLs家族成員的親緣關(guān)系，基于Lm4CL1、Lm4CL2蛋白的氨基酸序列，同時選擇擬南芥Arabidopsis thaliana、煙草Nicotiana tabacum、楊樹Populus tremuloides、雜交楊Populus trichocarpa×Populus deltoides、毛白楊Populus tomentosa、大 豆Glycine max、忍冬Lonicera japonica、桑葚Morus notabilis、丹參Salvia miltiorrhiza、三枝九葉草Epimedium sagittatum、覆盆子Rubus idaeus、蕓香Ruta graveolens、紫草Lithospermum erythrorhizon、茶樹Camellia sinensis、藿香Agastache rugosa、黃芩Scutellaria baicalensis、紅花Carthamus tinctorius、桔梗Platycodon grandiflorus、枇杷Eriobotrya japonica、圣羅勒Ocimum basilicum、葛根Pueraria lobata等21種植物的4CL蛋白序列作為參照，使用MEGA X軟件、鄰近法（Neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。聚類結(jié)果（圖4）顯示，Lm4CL1屬于ClassⅠ蛋白，Lm4CL2屬于ClassⅡ蛋白；Lm4CL1與忍冬（Lj4CL1）親緣關(guān)系最近，Lm4CL2與丹參（Sm4CL4）親緣關(guān)系最近。

圖4 不同植物中4CLs蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree of 4CLs in different plants

2.3.3 灰氈毛忍冬Lm4CLs蛋白結(jié)構(gòu)分析

以Lm4CL1、Lm4CL2蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建了這兩種4-香豆酸輔酶A連接酶的三維（3D）蛋白模型，闡明了蛋白的結(jié)構(gòu)特征。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，Lm4CL1有17個α-helices和21個β-strands（圖5A），Lm4CL2有17α-helices和25個β-strands（圖5B）。

使用煙草4CL2-5bsr.1.A (Nt4CL2)作為同源建模的模板，生成Lm4CL1蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖5C），Lm4CL1蛋白與模板的序列相似性為83.58%，模型的GMQE為0.96，QMEAN為0.65，建模質(zhì)量良好。Lm4CL1蛋白的三級結(jié)構(gòu)由一個大的N域和一個小的C域組成，N域由425個殘基組成（Glu-6到Asp-430），C域由96個殘基組成（Lys-437到Leu-532），N域和C域之間通過一個高度靈活的鏈接器“鉸鏈環(huán)”（Arg-431到Ile-436）連接。

使用煙草4CL2-5bsr.1.A (Nt4CL2)作為同源建模的模板，生成Lm4CL2的三維模型（圖5D），Lm4CL2與模板的序列相似性為39.27%，模型的GMQE為0.70，QMEAN為-2.27，建模質(zhì)量良好。Lm4CL2的模型結(jié)構(gòu)由一個大的N域和一個小的C域組成，N域由529個殘基組成（Asn-26到Asp-454），C域由96個殘基組成（Lys-461到Ala-556）。N域和C域之間通過一個高度靈活的鏈接器“鉸鏈環(huán)”（Arg-455到Ile-460）連接。

圖5 Lm4CL1和Lm4CL2的蛋白結(jié)構(gòu)模型Fig.5 Protein structural models of Lm4CL1 (A,C) and Lm 4CL2 (B,D)

2.4 灰氈毛忍冬Lm4CL1基因的原核表達

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold-Lm4CL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21 star (DE3)菌株的感受態(tài)細胞后，用IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖6），空白對照和陰性對照都沒目的蛋白表達，而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCold-Lm4CL的菌體經(jīng)濃度為0.4、0.6、0.8 mmol/L ITPG15℃誘導24 h后，在100 kD附近有清晰的蛋白條帶，該蛋白大小與目的蛋白大小一致（Lm4CL1蛋白大小為58.74 kD，pCold在N端有一個45.0 kD的分子伴侶TF）。此外，蛋白的表達量隨著IPTG濃度的提高表現(xiàn)出先增后降的規(guī)律，IPTG濃度為0.6 mmol/L時蛋白表達量最高。

圖 6 Lm4CL1基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of gene expression products

2.5 灰氈毛忍冬Lm4CLs基因的表達特征及與綠原酸含量的關(guān)系

以‘龍花’為試驗材料，分別在不同的組織部位及花器官的發(fā)育過程中分析了Lm4CL1、Lm4CL2基因的相對表達水平（圖7）。qRT-PCR結(jié)果顯示，Lm4CLs基因的表達存在明顯的組織特異性。Lm4CL1基因在莖中表達量最高，其次為葉，花中表達量最低；Lm4CL2基因在花中表達水平最高，其次為葉，莖中表達水平最低。隨著‘龍花’花器官的發(fā)育，Lm4CL1基因的表達量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，Lm4CL2基因的表達量在前期升高，中后期表達量穩(wěn)定。

圖7 Lm4CLs基因在‘龍花’不同組織部位的表達量Fig.7 Relative expression of Lm4CLs in Lonicera macranthoides ‘Longhua’

綠原酸含量分析結(jié)果（圖8）顯示，‘龍花’的莖、葉和花中均含有綠原酸，花中綠原酸含量顯著高于莖和葉。分析Lm4CLs基因表達水平與灰氈毛忍冬不同組織的綠原酸含量的相關(guān)性，結(jié)果表明Lm4CL1基因的表達量與綠原酸含量呈負相關(guān)（r=-0.63），Lm4CL2基因的表達量與綠原酸含量呈正相關(guān)（r=0.94）。

圖8 ‘龍花’不同組織部位的綠原酸含量Fig.8 Chlorogenic acid contents in Lonicera macranthoides ‘Longhua’

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

4CL基因在多種植物中已被成功克隆，并以基因家族的形式存在，如擬南芥中有3個4CL基因（At4CL1,At4CL2,At4CL3）[26]，煙草中有3個4CL基因（Nt4CL,Nt4CL1,Nt4CL2）[27]，楊樹中有2個4CL基因（Pt4CL1,Pt4CL2）[28]，雜交楊中有4個4CL基因（Ptd4CL1,Ptd4CL2,Ptd4CL3,Ptd4CL4）[29]，大豆中有4個4CL基因（Gm4CL3,Gm4CL4,Gm4CL3,Gm4CL4）[30]。研究發(fā)現(xiàn)4CL蛋白分為兩個大的進化類群，Ⅰ類主要與木質(zhì)素的合成有關(guān)，如擬南芥（At4CL1,At4CL2）、楊樹（Pt4CL1）、雜交楊（Ptd4CL1,Ptd4CL2）等；Ⅱ類與類黃酮的生物合成有關(guān)，如擬南芥（At4CL3）、大豆（Gm4CL3、Gm4CL4）、楊樹（Pt4CL1）等[11]。本研究通過灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出兩條注釋為4CL的基因片段，并克隆出Lm4CL1、Lm4CL2兩個4CL基因的全長cDNA序列。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，Lm4CL1基因與擬南芥中At4CL1、At4CL2基因，大豆中Gm4CL1、Gm4CL2基因，毛白楊Pto4CL1基因聚為Ⅰ類，這些基因都與植物木質(zhì)素的合成有關(guān)；Lm4CL2基因與擬南芥中At4CL3基因、毛白楊中Pto4CL2基因聚為Ⅱ類，而這些基因參與植物的類黃酮及其它物質(zhì)合成[31-33]。DNAMAN比對這些基因發(fā)現(xiàn)，保守結(jié)構(gòu)域Box I（SSGTTGLPKGV）中的亮氨酸（Leu）和脯氨酸（Pro）在Lm4CL2中被丙氨酸（Ala）和絲氨酸（Ser）替代，保守結(jié)構(gòu)域Box II（GEICIRG）中的半胱氨酸（Cys）和異亮氨酸（Ile）被色氨酸（Trp）和亮氨酸（Leu）替代，保守結(jié)構(gòu)域中氨基酸的改變可能直接導致Lm4CL2蛋白具有新的催化功能，但是蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還需要進一步的研究。

木質(zhì)部、葉片的維管組織等是植物木質(zhì)素生物合成的主要部位，在分析灰氈毛忍冬不同組織部位的樣品時發(fā)現(xiàn)，Lm4CL1基因在幼葉中有表達，在幼莖和主莖中的表達量明顯高于其它部位，結(jié)合進化分析結(jié)果，推測該基因與灰氈毛忍冬木質(zhì)素的生物合成相關(guān)，這與在忍冬中的研究結(jié)果不同[13]。Lm4CL2基因在花中表達水平最高，在花器官發(fā)育前期表達量急劇升高，后期表達量穩(wěn)定，且與綠原酸合成呈顯著正相關(guān)（r=0.94），推測Lm4CL2基因是調(diào)控灰氈毛忍冬綠原酸生物合成的重要基因。目前正在構(gòu)建灰氈毛忍冬遺傳轉(zhuǎn)化體系，為明確Lm4CL基因在灰氈毛忍冬中的功能和作用機制提供理論基礎(chǔ)。

3.2 結(jié) 論

從灰氈毛忍冬新品種‘龍花’中克隆獲得Lm4CL1和Lm4CL2兩個基因，兩者氨基酸相似性為35.15%，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示Lm4CL1屬于Ⅰ類蛋白，Lm4CL2屬于Ⅱ類蛋白；Lm4CL1在莖中呈現(xiàn)高表達且與綠原酸含量呈負相關(guān)（r=-0.63），Lm4CL2在花中呈現(xiàn)高表達且與綠原酸含量呈正相關(guān)（r=0.94），推測Lm4CL1基因與木質(zhì)素合成有關(guān)，Lm4CL2基因與綠原酸合成有關(guān)。