魚類肌間骨發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制及遺傳選育研究進(jìn)展

王旭東 聶春紅 高澤霞 ,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070; 2. 長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070;3. 湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，武漢 430070)

肌間骨, 俗稱魚刺, 是由肌膈中的肌腱骨化而來(lái), 僅存在低等真骨魚類中。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó),主要養(yǎng)殖大宗淡水魚類, 即青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽和魴[1], 都存在一定數(shù)量的肌間骨。肌間骨的存在不僅極大限制了其加工以及出口創(chuàng)匯, 而且也給食用這些魚類的人們帶來(lái)麻煩和一定的受傷風(fēng)險(xiǎn)。但因這些大宗淡水魚類味道鮮美、養(yǎng)殖技術(shù)容易掌握及歷史文化和傳統(tǒng)消費(fèi)習(xí)慣等因素, 使得大宗淡水魚在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位。據(jù)《2019中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì), 2018年我國(guó)大宗淡水魚產(chǎn)量占到了全國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的66.45%[2]。因此, 對(duì)肌間骨的相關(guān)研究, 如肌間骨形成的分子機(jī)制的解析及培育無(wú)刺或少刺的大宗淡水魚的育種技術(shù)也逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

長(zhǎng)期以來(lái), 人們對(duì)魚類肌間骨的研究主要集中在形態(tài)和數(shù)目方面[3—8]。近期, 常永杰等[9]發(fā)現(xiàn)刀鱭(Coilia nasus)和短頜鱭(C. brachygnathus)背部上方和腹部下方有肌骨桿(Myorhabdoi)。國(guó)內(nèi)對(duì)于肌骨桿的研究報(bào)道較少, 該發(fā)現(xiàn)對(duì)我國(guó)魚類肌間骨類型研究做了進(jìn)一步補(bǔ)充。Yang等[10]對(duì)12個(gè)亞科共592尾鯉科魚類肌間骨的發(fā)生進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化研究,研究揭示了鯉科魚類肌間骨的變異多樣性, 且與其系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān), 但又受到多種環(huán)境因素的影響,對(duì)肌間骨的發(fā)生演化做了進(jìn)一步補(bǔ)充。

隨著多學(xué)科的交叉融合, Fiedler等[11]研究了北大西洋鯡(Clupea harengus)肌間骨的微結(jié)構(gòu)及相關(guān)屬性, 采用機(jī)械拉伸試驗(yàn)、掃描電子顯微鏡法(Scanning electron microscopy, SEM)、寬角X射線散射法(Wide-angle X-ray scattering, WAXS)和micro-CT成像技術(shù)等方法評(píng)估了肌間骨組織礦物密度(Tissue Mineral Density, TMD)及肌間骨內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu), 進(jìn)而對(duì)北大西洋鯡大體形和小體形兩個(gè)群體的肌間骨進(jìn)行了比較分析。研究結(jié)果表明, 與其他類型的骨相比, 肌間骨具有十分特殊的剛度、強(qiáng)度和韌性。該研究為硬骨魚類骨骼生物力學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)特性提供了新的數(shù)據(jù)。

近年來(lái), 隨著生物技術(shù)的快速的發(fā)展, 研究人員開(kāi)始關(guān)注肌間骨骨化模式[12—14]、肌間骨相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制和少/無(wú)刺魚的培育等方面。何蘋萍等[15]、Lü等[16]、Nie等[17,18]和Wan等[19,20]研究了肌間骨骨化過(guò)程的分子機(jī)制及一些關(guān)鍵基因的調(diào)控作用。在育種方面, Tang等[21]和Xiong等[22]分別評(píng)估了鏡鯉(Cyprinus carpio var. specularis)和團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)肌間骨的遺傳力, 為開(kāi)發(fā)無(wú)或少肌間骨的相關(guān)品種奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。徐曉峰等[23]和Perazza等[24]分別發(fā)現(xiàn)無(wú)肌間骨突變體草魚(Ctenopharyngodon idella)和大蓋巨脂鯉(Piaractus brachypomus), 為探索肌間骨發(fā)生的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。因此, 本文綜合整理了有關(guān)肌間骨的研究資料, 主要從肌間骨相關(guān)的分子機(jī)制及育種前景等方面進(jìn)行了全面闡述。

1 肌間骨發(fā)育相關(guān)基因調(diào)控

1.1 BMP家族基因

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是1965年由Urist首次從成人骨組織中提取的一種活性蛋白質(zhì), 除了BMP-1外, 均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor, TGF-β)超基因家族[25,26]。目前, BMP家族基因已經(jīng)超過(guò)30種,Zhang等[27]據(jù)dCHIP分析將已發(fā)現(xiàn)的人類14種骨形態(tài)發(fā)生蛋白分為3種類型: BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和BMP9屬于成骨/成軟骨/成脂類型, BMP5、BMP11、BMP12、BMP13、BMP14和BMP15屬于肌腱發(fā)育類型, BMP3、BMP8和BMP10屬于BMP3類型[27]。BMP具有誘導(dǎo)成骨的作用, 被認(rèn)為是誘導(dǎo)骨形成及骨分化最早期的信號(hào)分子。BMP蛋白主要由單體形式通過(guò)二硫鍵結(jié)合形成二聚體[28]。BMP的同二聚體和異二聚體被報(bào)道能與有成骨潛能及未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞表面受體相互作用, 從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化[25,26]。BMP9被認(rèn)為是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的最有效因子之一[29]。

Zhang等[30]運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)初步分析了9個(gè)bmp基因在團(tuán)頭魴肌間骨4個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期中的表達(dá), 結(jié)果表明: 在肌間骨形成的早期階段,bmp3、bmp4、bmp5和bmp8a的表達(dá)量均上調(diào)。因此, 這些BMP家族基因可能參與刺激間充質(zhì)細(xì)胞向肌間骨生長(zhǎng)位點(diǎn)的遷移、聚集及成骨細(xì)胞的分化。在肌間骨快速發(fā)育時(shí)期, 只有bmp7b和bmp16表達(dá)急劇增加, 說(shuō)明bmp7b和bmp16可能參與成骨細(xì)胞分化和肌間骨的發(fā)育成熟。在團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育過(guò)程中, 表達(dá)量最高的bmp7bmRNA在肌間骨快速發(fā)育時(shí)期達(dá)到最高峰, 由此表明BMP-7b可能是肌間骨發(fā)育的強(qiáng)誘導(dǎo)因子, 用于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)育成熟。在肌間骨完全發(fā)育成熟的時(shí)期,bmp2a、bmp2b、bmp3、bmp4、bmp8a和bmp14相對(duì)于其他骨化時(shí)期的表達(dá)量顯著增加, 推測(cè)這些基因?qū)S持肌間骨結(jié)構(gòu)等方面有重要作用。Yang等[31]對(duì)羅非魚和團(tuán)頭魴的bmp2a/b基因的研究表明,bmp2b主要在肌間骨、肋骨和鰭條等骨相關(guān)的組織表達(dá), 而bmp2a主要在肌肉、脾和心臟等外周組織表達(dá)。由此說(shuō)明,bmp2b可能與肌間骨的發(fā)生發(fā)育密切相關(guān)。Su和Dong[32]在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平比較分析了bmp4基因在鯉和羅非魚的背部肌肉、腹部肌肉和尾部肌肉的表達(dá)情況, 結(jié)果表明bmp4基因在鯉背部和尾部肌肉這兩處含有肌間骨的組織中高表達(dá), 其他4個(gè)組織也有表達(dá), 但表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在鯉的背部和尾部肌肉中的表達(dá)量。通過(guò)對(duì)有無(wú)肌間骨魚類和有無(wú)肌間骨組織的比較, 說(shuō)明bmp4基因可能是調(diào)控肌間骨的重要基因。

1.2 肌腱發(fā)育相關(guān)基因

有研究認(rèn)為肌間骨是由肌腱骨化而來(lái)的[33,34]。在肌腱發(fā)育過(guò)程中, Scleraxis(SCX)和Tenomodulin(TNMD)等作為肌腱發(fā)育的特異性轉(zhuǎn)錄因子受到廣泛關(guān)注。SCX是一個(gè)含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)的轉(zhuǎn)錄因子, 是肌腱祖細(xì)胞最早的標(biāo)志, 在肌腱的發(fā)育成熟中起了重要的作用[35]。在哺乳動(dòng)物中, Tomoya等[36]利用scx-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠研究了SCX在肌腱損傷后修復(fù)作用, 結(jié)果表明SCX是一個(gè)重要的加快修復(fù)損傷成熟肌腱的分子靶標(biāo)。Shukunami等[37]應(yīng)用TALEN介導(dǎo)基因編輯技術(shù)獲得scx–/–小鼠表現(xiàn)出肌腱發(fā)育不良的表型。同時(shí), Shukunami等[37]也發(fā)現(xiàn)SCX是tnmd基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 在scx–/–小鼠的肌腱和韌帶中tnmd基因幾乎不表達(dá)。TNMD是一種肌腱/韌帶特異性標(biāo)記物和抗血管生成分子, 屬于II型跨膜糖蛋白, 含有高度保守的c-末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域[38,39]。Yin等[39]發(fā)現(xiàn)tnmd–/–小鼠的肌腱干細(xì)胞基因表達(dá)譜顯著改變, 表現(xiàn)為細(xì)胞對(duì)I型膠原質(zhì)黏附不足, 細(xì)胞外基質(zhì)的收縮能力受損。

在硬骨魚類的研究中, Nie等[40]通過(guò)Crispr/Cas9基因敲除技術(shù)分別獲得了scxa–/–和scxb–/–斑馬魚突變體,scxa–/–斑馬魚與野生型斑馬魚相比背部肌間骨消失, 僅尾部含有少量肌間骨; 進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)scxa–/–斑馬魚肌腱發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量均下調(diào)。而scxb–/–斑馬魚肌間骨表型與野生斑馬魚無(wú)異。該研究表明scxa基因可控制硬骨魚類肌間骨的數(shù)量性狀。陳宇龍等[41]研究了肌腱發(fā)育相關(guān)基因tnmd和xirp2a在團(tuán)頭魴肌間骨不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá), 研究結(jié)果表明tnmd基因在團(tuán)頭魴肌間骨快速發(fā)育時(shí)期表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期, 而xirp2a基因在肌間骨發(fā)育各個(gè)時(shí)期沒(méi)有顯著差異。該研究指出tnmd基因可能對(duì)肌間骨的發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。

1.3 硬化蛋白基因

硬化蛋白(Sclerostin, SOST)是一種含有213個(gè)氨基酸的糖蛋白, 在骨細(xì)胞中特異性表達(dá)[42], 抑制成骨細(xì)胞的活動(dòng), 其主要作用是抑制Wnt/β-catenin通路, 從而抑制骨的形成。在sost基因敲降的小鼠中可以觀察到高骨量的表型, 并且抗骨質(zhì)流失[43]。硬化蛋白抗體能夠刺激骨形成, 這為治療骨質(zhì)疏松提供了一種新的方法[44]。

硬化蛋白基因在硬骨魚類肌間骨中的研究較少。楊敏璇等[45]利用分子生物技術(shù)體外克隆鯽(Carassius auratus)sost基因全長(zhǎng), 并構(gòu)建原核表達(dá)載體, 體外表達(dá)硬化蛋白。結(jié)果表明, 隨著時(shí)間的遞增, 硬化蛋白表達(dá)量逐漸增大, 誘導(dǎo)時(shí)間為4h左右其表達(dá)量最高。該研究表明, 信號(hào)肽存在對(duì)sost基因的蛋白表達(dá)存在抑制影響。房連聰[46]對(duì)淇河鯽肌間骨發(fā)育時(shí)期的研究推測(cè), SOST可能參與淇河鯽肌間骨骨化負(fù)調(diào)控, 對(duì)骨骼發(fā)育存在抑制作用。王良炎等[47]對(duì)淇河鯽成魚不同肌間骨相鄰肌組織的研究發(fā)現(xiàn),sost在肌隔組織中大量表達(dá)且在淇河鯽背部肌肉中存在差異性表達(dá)。田雪等[48]以淇河鯽仔稚魚為研究對(duì)象, 檢測(cè)sost基因在肌間骨不同骨化階段的mRNA和蛋白表達(dá)變化情況, 結(jié)果表明該基因在肌間骨完全成熟后表達(dá)量達(dá)到最高,推測(cè)sost基因與鯽的肌間骨生長(zhǎng)有一定相關(guān)性。

1.4 其他基因

在脊椎動(dòng)物中, 肌節(jié)同源盒(Muscle segment homeobox, MSX)在上皮-間充質(zhì)的交互作用中發(fā)揮重要作用, 促進(jìn)器官的形成[49]。Lü等[16]運(yùn)用整胚原位雜交和qRT-PCR技術(shù)研究Msx-C在唇?(Hemibarbus labeo)肌間骨發(fā)生過(guò)程中的作用。Msx-C基因在唇?26—41 dph(Day post hatching)在肌膈中表達(dá), 該基因與唇?肌間骨骨化過(guò)程(35—62 dph)一致, 表明Msx-C基因在唇?肌間骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

TWIST是高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix, bHLH)家族中的轉(zhuǎn)錄因子, 參與中胚層衍生組織(包括骨骼)的發(fā)育[50]。脊椎動(dòng)物有兩種twist基因, 即twist1和twist2[51]。研究發(fā)現(xiàn),twist1和twist2對(duì)小鼠骨骼的發(fā)育具有調(diào)控作用[52]。陳潔等[53]通過(guò)qPCR研究twist1和twist2在唇?肌間骨發(fā)育的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)情況, 結(jié)果表明twist1表達(dá)量隨肌間骨發(fā)育逐漸降低, 肌間骨快速發(fā)育和成熟時(shí)期twist1表達(dá)量與肌間骨未發(fā)育時(shí)期相比顯著降低;twist2從肌間骨未發(fā)育時(shí)期到肌間骨快速發(fā)育時(shí)期表達(dá)量并未發(fā)生顯著變化, 到肌間骨完全成熟時(shí)期其表達(dá)量才顯著降低。這表明twist1/2基因的表達(dá)與肌間骨骨化存在一定的相關(guān)性。

當(dāng)前, 對(duì)于魚類骨骼發(fā)育的研究還比較缺乏,研究進(jìn)展情況落后于在人類和哺乳動(dòng)物的相關(guān)研究。同時(shí), 魚類相對(duì)于人類和哺乳動(dòng)物的進(jìn)化地位低, 相同基因在進(jìn)化過(guò)程中其功能可能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。而且在活體水平的基因編輯會(huì)或多或少的受到補(bǔ)償效應(yīng)的作用, 從而對(duì)表型觀察等產(chǎn)生影響。綜合來(lái)看, 魚類肌間骨發(fā)育相關(guān)基因仍有待挖掘和探索。

2 肌間骨相關(guān)組學(xué)分析

目前, 大多數(shù)肌間骨的研究主要是集中在個(gè)體發(fā)生發(fā)育的形態(tài)學(xué)分析, 對(duì)肌間骨發(fā)育分子調(diào)控方面的研究相對(duì)較少。近些年, 隨著高通量測(cè)序技術(shù)和分子技術(shù)的發(fā)展, 越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始運(yùn)用組學(xué)技術(shù)和分子技術(shù)揭示肌間骨發(fā)生發(fā)育的分子機(jī)制(表 1)。

2.1 轉(zhuǎn)錄組

基于高通量測(cè)序技術(shù), Wan等[19]首次比較分析了6月齡團(tuán)頭魴肌間骨(IBs)和包含肌間骨的結(jié)締組織(CT)的miRNA分子特征, 獲得218個(gè)已知miRNA基因的序列和相應(yīng)表達(dá)水平。結(jié)果表明MiR-206是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子, 對(duì)成骨細(xì)胞分化起到抑制作用。通過(guò)stem-loop實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)11個(gè)差異表達(dá)miRNA在9個(gè)組織上進(jìn)行驗(yàn)證, 結(jié)果表明mam-miR-221、mam-miR-222a、mam-miR-92a和mam-miR-26a在肌間骨和含肌間骨的結(jié)締組織中表達(dá)量相對(duì)較高, 說(shuō)明其在肌間骨發(fā)育中發(fā)揮一定作用。

隨后, Wan等[20]比較分析了團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期(S1. 肌間骨未發(fā)生; S2. 肌間骨初步發(fā)生;S3. 肌間骨快速發(fā)育; S4. 肌間骨發(fā)育完全)mRNA和miRNA的分子特征, 并對(duì)二者進(jìn)行整合分析。結(jié)果表明TGF-β信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路、ERK信號(hào)通路互作, 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。在團(tuán)頭魴肌間骨4個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期中, 有22個(gè)miRNA持續(xù)上調(diào)和18個(gè)miRNA持續(xù)下調(diào)。通過(guò)整合分析發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的與肌間骨形成有關(guān)的mRNA-miRNA互作對(duì),在細(xì)胞水平驗(yàn)證了miR-133對(duì)靶基因Tgfbr1a的調(diào)控作用。

何蘋萍等[15]對(duì)禾花鯉(C. carpio var. Quanzhounensis)和建鯉(C. carpio var.Jian)肌間骨進(jìn)行miRNA的高通量測(cè)序, 據(jù)差異表達(dá)結(jié)果推測(cè), 肌間骨的發(fā)育可能是通過(guò)下調(diào)促進(jìn)成骨miRNA的表達(dá)量及上調(diào)抑制成骨miRNA的表達(dá)量來(lái)抑制成骨過(guò)程, 從而維持禾花鯉肌間骨細(xì)小及柔軟的特性。Peng等[54]比較分析禾花鯉和建鯉肌間骨mRNA和microRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異表達(dá)基因和12個(gè)差異表達(dá)miRNA參與禾花鯉骨礦化調(diào)控過(guò)程。隨著團(tuán)頭魴全基因組測(cè)序的完成, Liu等[55]對(duì)3種關(guān)鍵組織(肌間骨、肌間骨外周結(jié)締組織和背部白肌)進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析, 進(jìn)一步確認(rèn)了所觀察到的基因表達(dá)差異確實(shí)與肌間骨的形成和功能有關(guān)。

2.2 蛋白組

Nie等[17]通過(guò)iTRAQ LC-MS/MS蛋白組學(xué)定量分析技術(shù)構(gòu)建了魚類肌間骨和肋骨的第一張蛋白組圖譜。經(jīng)蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 一齡團(tuán)頭魴肌間骨和肋骨之間的93個(gè)差異表達(dá)蛋白造成一齡團(tuán)頭魴肌間骨和肋骨的化學(xué)組成差異, 二齡團(tuán)頭魴肌間骨和肋骨間存在154個(gè)差異表達(dá)蛋白造成上述2種骨間的化學(xué)組成差異; 與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的玻連蛋白b前體和金屬蛋白酶2在肋骨中顯著上調(diào)表達(dá); 在團(tuán)頭魴的不同年齡階段(一齡、二齡)發(fā)現(xiàn)13個(gè)肌間骨發(fā)育相關(guān)候選蛋白和11個(gè)肋骨發(fā)育相關(guān)候選蛋白。通過(guò)KEGG分析在235個(gè)通路中共定位了2023個(gè)蛋白, 其中在肌間骨發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路, 如MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路及破骨細(xì)胞分化途徑分別鑒定出60、41、20、17和11種蛋白。通過(guò)GO注釋分析,HCM信號(hào)通路為差異表達(dá)蛋白最多的通路。在肋骨和肌間骨中共同表達(dá)45個(gè)蛋白, 僅有LAMA2表達(dá)上調(diào), 其余44種蛋白表達(dá)下調(diào)。基于蛋白組數(shù)據(jù),Nie等[17]對(duì)ECM、MAPK、GnRH及鈣離子通路中蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行分析。在ECM信號(hào)通路中鏈狀膠原蛋白a1(V)等18個(gè)蛋白在一齡團(tuán)頭魴肋骨組織中高表達(dá); 肌腱蛋白樣蛋白、層黏連蛋白亞基a-2和tnc蛋白在一齡團(tuán)頭魴肌間骨中的表達(dá)量最高。

表 1 低等硬骨魚類肌間骨相關(guān)基因和組學(xué)研究Tab. 1 Summary of studies on genes or omics related to intermuscular bone in lower teleosts

2.3 多組學(xué)整合分析

在肌間骨的組織結(jié)構(gòu)和成分研究方面, Nie等[17]通過(guò)HE染色切片法比較分析了一齡和二齡團(tuán)頭魴肌間骨和肋骨, 切片結(jié)果表明兩種骨組織均含有三種典型的骨形成細(xì)胞, 即破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞, 但在一齡和二齡團(tuán)頭魴肋骨中均發(fā)現(xiàn)一個(gè)富含破骨細(xì)胞的骨腔, 而肌間骨不存在類似骨腔。通過(guò)使用阿利新藍(lán)染色(用于軟骨細(xì)胞染色)和茜素紅染色(用于組織鈣鹽反應(yīng))等不同的染色方法分析,Nie等[18]對(duì)團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的個(gè)體進(jìn)行整體染色觀察的研究, 結(jié)果表明肌間骨礦化從S2時(shí)期開(kāi)始, S2到S4時(shí)期鈣沉積量持續(xù)增加; 但在肌間骨發(fā)育過(guò)程中無(wú)軟骨細(xì)胞形成, 表明肌間骨的骨化方式為膜內(nèi)骨化。隨后, Nie等[18]綜合了組織學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)全面分析了肌間骨的骨化模式, 通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術(shù)鑒定得到3368個(gè)蛋白, 功能注釋表明MARK信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路是骨發(fā)生過(guò)程中的主要信號(hào)通路。經(jīng)蛋白組學(xué)和定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白(COLLAGEN9A1、STAT1和TNC)在肌間骨發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量無(wú)顯著差異, 而與成骨細(xì)胞和骨形成相關(guān)蛋白(ENTPD5、CASQ1A、PVALB、ANXA2A和ANXA5)表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期間具有顯著的差異性, 從蛋白組學(xué)的角度進(jìn)一步驗(yàn)證了肌間骨骨化不經(jīng)歷軟骨階段的觀點(diǎn)。

Chen等[56]通過(guò)全基因組和轉(zhuǎn)錄組綜合分析, 獲得了MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、ECM受體互作及Notch信號(hào)通路等團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路, 尤其是ECM受體互作和Notch信號(hào)通路在全基因組和轉(zhuǎn)錄組兩種分析中均得到富集。隨后在轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了以上通路中的相關(guān)基因(itgal、itga6a、lamb1b、col6a3、dvl1a和oser1), 結(jié)果表明這些基因均在團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育S3時(shí)期比S1時(shí)期顯著高表達(dá), 與轉(zhuǎn)錄組水平相同。

近期, 基于在大蓋巨脂鯉養(yǎng)殖群體中發(fā)現(xiàn)了缺失肌間骨的個(gè)體[24], 研究團(tuán)隊(duì)對(duì)突變體進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析[57], 篩選到了13個(gè)與減少骨量、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收和骨礦化等相關(guān)功能相關(guān)的基因, 包括actn3b、adamtsl2、atp6v0a1a、atp6v0ca、dchs1b、ebf3a、efnb1、nmu、ntn4、pde4d、plek、wisp1b和xpr1b。

基于魚類肌間骨相關(guān)組學(xué)和基因表達(dá)信息, 總結(jié)出從肌腱源干細(xì)胞-成骨細(xì)胞前體細(xì)胞-成骨細(xì)胞-肌間骨形成過(guò)程中發(fā)揮一定作用的通路及相關(guān)基因(圖 1), 為進(jìn)一步探討魚類肌間骨發(fā)育的機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)信息。

圖 1 硬骨魚類肌間骨發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制Fig. 1 The molecular mechanism related to intermuscular bone in teleosts

3 肌間骨性狀的遺傳選育

目前, 國(guó)內(nèi)大宗淡水魚類及印度、巴西等國(guó)家主要養(yǎng)殖的魚類品種均含有肌間骨, 對(duì)魚類經(jīng)濟(jì)效益和食用安全產(chǎn)生了一定的影響。一些研究學(xué)者致力于運(yùn)用育種手段來(lái)減少或去除魚類肌間骨, 已取得一些明顯的進(jìn)展[58](表 2)。

3.1 選擇育種

自20世紀(jì)70、80年代起, 以群體選育和家系選育為主的選擇育種已廣泛應(yīng)用于水生生物的遺傳改良工作中[59], 而研究人員對(duì)減少肌間骨數(shù)量方法探究開(kāi)始于1967年[60]。雖然這些方法探究沒(méi)有獲得少肌間骨魚類品種[58], 但許多研究發(fā)現(xiàn)在鯉科魚類中肌間骨數(shù)量存在顯著的遺傳變異現(xiàn)象[60,61], 這種遺傳變異現(xiàn)象表明選擇育種可應(yīng)用于減少肌間骨數(shù)量的相關(guān)研究[58]。

近些年, Cao等[62]對(duì)鏡鯉、柏氏鯉(C. pellegrini)與黑龍江鯉(C. carpio)的雜交鯉、荷包鯉的耐寒品系等3種魚的肌間骨數(shù)量和形態(tài)變異情況進(jìn)行比較分析, 與其他兩種魚相比, 鏡鯉肌間骨的數(shù)量最少, 變異系數(shù)也較高。結(jié)果表明鏡鯉是一種可用于選擇育種減少肌間骨的材料, 并且認(rèn)為通過(guò)選擇育種可以有效減少魚體后部肌間骨數(shù)量。Tang等[21]首次對(duì)鏡鯉肌間骨進(jìn)行遺傳力和數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Loci, QTLs)分析, 結(jié)果表明鏡鯉肌間骨數(shù)量為中等遺傳力性狀并發(fā)現(xiàn)8個(gè)肌間骨QTLs和29個(gè)肌間骨相關(guān)的候選基因。該研究為鯉肌間骨分子機(jī)制的深入研究提供了資料。Xiong等[22]研究表明團(tuán)頭魴整體肌間骨數(shù)量變異系數(shù)為6.98%, 而脈弓小骨數(shù)量變異系數(shù)高達(dá)13.63%,顯著高于髓弓小骨數(shù)量的變異系數(shù)(6.60%)。對(duì)83個(gè)全同胞家系團(tuán)頭魴的肌間骨數(shù)量遺傳力進(jìn)行評(píng)估顯示, 髓弓小骨數(shù)量為低遺傳力(0.13), 脈弓小骨數(shù)量為中等遺傳力(0.37)。Xiong等[22]認(rèn)為可以通過(guò)家系選擇育種來(lái)有效減少脈弓小骨數(shù)量。在20世紀(jì)90年代后期, DNA分子標(biāo)記輔助育種的出現(xiàn)加快了育種進(jìn)程[63]。馬吉敏等[64]從200個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出149個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 經(jīng)關(guān)聯(lián)性分析獲得8個(gè)與鏡鯉肌間骨數(shù)量顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。Wan等[65]利用混合分組分析(Bulked segregant analysis, BSA)方法檢測(cè)團(tuán)頭魴肌間骨極少(＜100)和極多(＞130)兩個(gè)群體中的SNPs, 共確定了6074個(gè)SNPs且最終篩選出181個(gè)與團(tuán)頭魴肌間骨數(shù)量相關(guān)的候選SNP位點(diǎn)。該研究首次探索了SNPs位點(diǎn)與肌間骨數(shù)量的關(guān)聯(lián)性, 為肌間骨數(shù)量相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

表 2 魚類肌間骨性狀相關(guān)的遺傳改良研究Tab. 2 Summary of studies on genetic improvement of fishes related to intermuscular bone traits

3.2 雜交育種

除選擇育種外, 雜交育種也是最基礎(chǔ)且得到廣泛應(yīng)用的育種技術(shù)之一[59]。一些研究人員對(duì)不同魚類進(jìn)行雜交, 對(duì)獲得的后代進(jìn)行肌間骨相關(guān)分析研究。聶春紅等[64]對(duì)團(tuán)頭魴與其他3種魴屬魚類[三角魴(M. skolkovii)、廣東魴(M. terminalis)和厚頜魴(M. pellegrini)]正反交及親本自交后代共10 種雜交組合子代的肌間骨數(shù)目、形態(tài)、分布和長(zhǎng)度進(jìn)行了比較分析。研究結(jié)果表明, 魴屬魚類近緣雜交子一代的肌間骨相關(guān)性狀特征無(wú)顯著改變。蔣文枰等[67]對(duì)鲌魴F1代、鲌魴F2代和母本翹嘴鲌(Culter alburnus)、父本團(tuán)頭魴肌間骨的數(shù)目、形態(tài)和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 研究表明鲌魴F1代、鲌魴F2代在肌間骨數(shù)目和形態(tài)復(fù)雜性方面較母本有所減少, 并且F2代較F1代還呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。鐘澤洲[68]對(duì)團(tuán)頭魴、翹嘴紅鲌、鲌魴F1代及翹嘴鳊4種不同雜交魚的肌間骨的數(shù)目、形態(tài)和分布進(jìn)行研究, 結(jié)果說(shuō)明翹嘴鳊等人工培育的雜交魚比原始親本翹嘴紅鲌、團(tuán)頭魴的肌間骨少。Guo等[69]研究廣東魴(♀)和翹嘴鲌(♂)屬間雜交F1代的肌間骨數(shù)目形態(tài)特征, 發(fā)現(xiàn)鲌魴F1代肌間骨的數(shù)目和形態(tài)復(fù)雜程度相對(duì)父本均有所下降, 而相對(duì)母本有所升高, 具有一定程度的雜種優(yōu)勢(shì)。Wu等[70]用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)培育的新型雜交鲌(團(tuán)頭魴♀×翹嘴鲌♂)肌間骨數(shù)量相對(duì)于父本肌間骨量減少5.7%。李志等[71]比較分析了不同月齡異育銀鯽A+品系和候選新品系F系的肌間骨形態(tài)數(shù)量差異, 研究結(jié)果表明, 候選新品系F系髓弓小骨表現(xiàn)出形態(tài)復(fù)雜程度低、數(shù)量減少的性狀,相對(duì)于A+系有利于食用的優(yōu)勢(shì)。

3.3 多倍體和雌核發(fā)育育種

多倍體育種和人工雌核生殖屬于細(xì)胞工程育種技術(shù), 是在細(xì)胞或染色體組水平上進(jìn)行遺傳改良的育種技術(shù)[59]。黎玲等[72]比較了5種不同倍性魚肌間骨的數(shù)目、形態(tài)和分布, 結(jié)果表明改良二倍體紅鯽和改良三倍體鯽等人工培育的雜交魚比野生鯽的肌間骨數(shù)量少, 為培育少或無(wú)肌間骨魚類提供一種育種方法。關(guān)檸楠等[73]對(duì)86尾雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體肌間骨的數(shù)目、形態(tài)、分布和長(zhǎng)度進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明, 與正常的團(tuán)頭魴群體肌間骨的數(shù)目相比, 該群體的肌間骨的數(shù)目并沒(méi)有明顯減少。徐曉鋒等[23]通過(guò)人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育純合二倍體草魚(Ctenopharyngodon idellus)使突變基因的性狀顯現(xiàn), 在5尾散鱗突變體草魚中篩選出了1尾正常發(fā)育的無(wú)肌間骨的草魚。

3.4 基因編輯育種

此外, 隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展, Zhong等[74]使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除鯉sp7a基因, 結(jié)果表明sp7a–/–突變體存在明顯的肌間骨變短的現(xiàn)象, 但突變體同時(shí)存在骨缺損, 包括鰓蓋、上頜骨功能不全和背部彎曲等問(wèn)題。Nie等[40]通過(guò)基因編輯技術(shù)分別獲得了scxa基因突變斑馬魚, 突變體與野生型斑馬魚相比背部無(wú)肌間骨, 僅尾部含有少量肌間骨, 總數(shù)較野生型減少約70%, 個(gè)別突變體雖然存在肋骨發(fā)育缺陷和肌膈發(fā)育缺陷, 但整體生命活動(dòng)和繁殖能力與野生型沒(méi)有明顯差異。楊建等[75,76]同樣通過(guò)基因編輯技術(shù)獲得了無(wú)肌間骨的斑馬魚突變品系, 雖然作者沒(méi)有指出具體的基因, 但通過(guò)qRT-PCR對(duì)比分析5個(gè)肌肉特異性基因(mef2、myf5、myod、myog和sox6)和6個(gè)骨骼發(fā)育相關(guān)基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)在無(wú)肌間骨突變品系和野生斑馬魚中的表達(dá)情況, 結(jié)果表明肌間骨存在與否對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育以及肌肉發(fā)育無(wú)顯著影響; 肌間骨缺失對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育無(wú)顯著影響, 只在胚胎發(fā)育時(shí)期影響骨骼相關(guān)基因表達(dá)水平的變化, 結(jié)合組織學(xué)染色結(jié)果推測(cè),肌間骨缺失對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育無(wú)顯著影響。

4 研究展望

世界上對(duì)魚類肌間骨的遺傳育種研究最早始于1967年, 之后近50年, 這方面的研究進(jìn)展比較慢。從圖 2可以看出, 自2010年后, 越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始圍繞魚類肌間骨分子遺傳機(jī)制和遺傳育種開(kāi)展研究。研究肌間骨的分子機(jī)制對(duì)揭示魚類肌間骨的系統(tǒng)進(jìn)化有著重要意義, 隨著分子編輯技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 通過(guò)開(kāi)展有肌間骨和無(wú)肌間骨魚類肌膈中肌腱組織細(xì)胞類型的確定和基因表達(dá)差異性研究, 篩選鑒定誘導(dǎo)有肌間骨魚類肌腱源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因;通過(guò)基因過(guò)表達(dá)和基因功能缺失等研究方法明確基因的調(diào)控功能, 闡明魚類肌間骨發(fā)育的分子機(jī)制,進(jìn)一步可通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)培育少或無(wú)肌間骨的魚類。

此外, 肌間骨的遺傳力為中等遺傳力且一些與肌間骨數(shù)量相關(guān)的標(biāo)記基因也被篩選鑒定, 這些標(biāo)記基因可以被用來(lái)指導(dǎo)少肌間骨魚類的選育, 尤其是鯉科魚類。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本的降低, 二代/三代測(cè)序技術(shù)與全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome wide association studies, GWAS)技術(shù)也可以用來(lái)確定與肌間骨數(shù)量相關(guān)的標(biāo)記基因, 進(jìn)一步提高少肌間骨魚類選育的準(zhǔn)確性。無(wú)肌間骨的草魚或巴西大蓋巨脂鯉可以用來(lái)與正常個(gè)體雜交,在獲得F1代基礎(chǔ)上進(jìn)而形成F2家系, 用于QTL定位肌間骨有/無(wú)的關(guān)鍵基因, 為后續(xù)研究肌間骨的分子機(jī)制以及開(kāi)展無(wú)肌間骨的魚類選育奠定基礎(chǔ)。中國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖已為世界做出重要貢獻(xiàn), 若能培育出無(wú)“小刺”的主養(yǎng)大宗魚, 必將成為對(duì)世界水產(chǎn)的又一重大貢獻(xiàn)。

圖 2 硬骨魚類肌間骨相關(guān)分子機(jī)制及遺傳育種研究時(shí)間進(jìn)程Fig. 2 The time course of molecular mechanism and genetic breeding related to intermuscular bone in teleosts