采自青海湖的剛毛藻屬一新種
——青海剛毛藻

趙志娟 朱 歡 熊 雄 何玉邦 敖鴻毅 吳辰熙 胡愈炘 劉國祥

(1. 南寧師范大學北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點實驗室, 南寧 530001; 2. 南寧師范大學廣西地表過程與智能模擬重點實驗室, 南寧 530001; 3. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072;4. 青海湖國家級自然保護區(qū)管理局, 西寧, 810007)

青海湖地處青藏高原東北部, 湖泊面積約4400 km2, 是我國最大的咸水湖泊(鹽度約6‰—12‰)。青海湖因其獨特的海拔、氣候和地理位置成為我國西部著名的旅游風景區(qū)。但是自2013年以來, 每年7—9月青海湖均頻頻暴發(fā)絲狀藻類水華, 大量黃綠色藻類漂浮于水體表面, 對水體生態(tài)系統(tǒng)造成了一定污染和危害。目前關(guān)于青海湖藻類的研究主要集中于浮游植物種類多樣性調(diào)查、生物量監(jiān)測及營養(yǎng)鹽對藻類生長的影響等方面[1—5]。已報道過的絲狀綠藻有轉(zhuǎn)板藻、無隔藻、絲藻、水綿、雙星藻和剛毛藻等,這些絲狀藻類的調(diào)查主要依靠形態(tài)學觀察, 極少結(jié)合分子序列進行分析[3]。

本研究對青海湖岸邊暴發(fā)的水華絲狀藻類進行樣品采集, 并將其帶回實驗室開展顯微形態(tài)觀察和分子序列測定, 以分析絲狀藻類所屬種類及其典型特征, 以期為青海湖的水環(huán)境治理和生態(tài)建設提供理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究分別在2013—2015年8月對青海湖沿岸發(fā)生絲狀藻類水華的位點進行樣品采集, 采集后的樣品同時進行3種方式保存: 10%的甲醛固定保存、干燥保存及低溫新鮮樣品保存。所有保存樣品均帶回實驗室處理, 樣品編號依次為QH1401、QH1402、QH1403、QH1404、QH1501、QH1502、QH1504和QH1505, 甲醛固定的樣品保存于中國科學院水生生物研究所。

1.2 形態(tài)觀察

顯微形態(tài): 在體式鏡(KL1500 LCD; Zeiss, G?ttingen, Germany)下用解剖針小心將目的藻絲分離,置于磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.0)中反復清洗3次, 去除表面附著的雜質(zhì)。將干凈藻絲置于光學顯微鏡下進行顯微形態(tài)觀察并測量拍照。關(guān)注的形態(tài)特征包含藻絲分枝類型、直徑大小、細胞長寬比和有無固著器等, 同時收集干凈藻絲以備DNA提取使用。

標本制作: 將新鮮藻樣置于放有清水和標本紙的干凈操作盤中, 在解剖鏡下用解剖針輕輕分開各分枝, 吸走多余水分, 待標本紙?zhí)幱诎敫蔂顟B(tài)時涂上適量膠水, 自然風干壓制成標本, 做好的干標本可用于藻絲宏觀形態(tài)觀察, 標本保存于中國科學院水生生物研究所。

1.3 DNA提取

單細胞法提取藻絲DNA: 將收集的絲狀綠藻用ddH2O反復洗滌3—4次, 置于顯微鏡下鏡檢。鏡檢后的藻絲轉(zhuǎn)移至滴有緩沖液的載玻片上, 用解剖刀切割單個細胞, 使內(nèi)含物釋放; 用移液槍收集細胞內(nèi)含物并轉(zhuǎn)移至已滅菌的PCR管中。加入合適比例的蛋白酶K, 混勻, 置于55℃水浴0.5h; 最后高溫(95℃, 5min)滅活蛋白酶K, 即獲得樣品總DNA。

1.4 PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增核糖體小亞基編碼基因(Small subunit ribosomal encoding gene, SSU)和大亞基編碼基因(Large subunit ribosomal encoding gene, LSU)的方法參照Boedeker等[6]和Leliaert等[7]對剛毛藻目藻樣的處理方法[6,7], 參照Hayakawa等[8]的方法擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列。PCR產(chǎn)物送生物公司(擎科生物, 武漢)測序。對于直接測序效果不佳的PCR產(chǎn)物, 用pMD18-T(寶生物, 大連, 中國)載體連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中, 培養(yǎng)篩選后重新PCR并測序。測序結(jié)果使用Seqman軟件拼接(Swindell and Plasterer, 1997)[9]。利用Mafft 7.2(Katoh and Standley, 2013)進行序列比對[10], 使用Bioedit 7.0(Hall, 2004)手工校正[11], 人工校正后的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫。對ITS序列(序列間差異較大)開展獨立進化分析, 對于SSU和LSU序列(序列較為保守)開展聯(lián)合進化分析。分析前首先進行SSULSU聯(lián)合序列不相合長度差異檢驗,P＞0.05, 表明數(shù)據(jù)集可聯(lián)合分析。以上數(shù)據(jù)集分別采用似然法(ML)和貝葉斯算法(BI)對數(shù)據(jù)進行運算。前者通過RaxML(Stamatakis等[12])軟件完成, 后者通過MrBayes 3.1.2完成(Huelsenbeck 和 Ronquist[13])。RaxML樹和BI貝葉斯樹分別在相應分支上獲得自展支持值(BP)和后驗概率值(PP)。

2 結(jié)果

2.1 新種確認

青海剛毛藻Cladophora qinghaiensisZ.J.ZHAO & G.X. LIU, sp. nov. 圖版 Ⅰ-a—h

植物體生長于咸水環(huán)境, 鹽度范圍: 6‰—12‰。藻絲纖細柔軟, 呈綠色或淺綠色, 分枝旺盛, 具明顯的頂端生長和居間生長(圖版Ⅰ-a—c)。葉綠體網(wǎng)狀, 周生。大多數(shù)藻絲通過固著器著生于岸邊沙石等基質(zhì)上(圖版Ⅰ-d)。細胞均勻, 多圓柱形, 頂細胞逐漸變細, 末端為鈍頂末梢(圖版Ⅰ-e)。細胞近頂端常產(chǎn)生分枝, 與主枝形成銳角(45°或更小), 典型的偽二歧分枝或者下方偽二歧分枝(圖版Ⅰ-f)。隨著生長, 有些細胞頂部可以產(chǎn)生3個、4個甚至5個分枝(圖版Ⅰ-g)。有時植物體末端分枝或細胞會呈現(xiàn)輕微彎曲或卷曲現(xiàn)象(圖版Ⅰ-h)。植物體細胞直徑較小, 主軸細胞直徑30.0—90.0 μm, 細胞長寬比2.4—8.0。分枝細胞直徑25.0—70.0 μm, 長寬比4.0—12.3。頂端細胞直徑25.0—50.0 μm, 長寬比3.6—12.0。溫度變化、水流沖擊或者植物體老化等因素可能導致植物體斷裂或變短, 進而形成絲狀團塊漂浮于水面上, 顏色趨于黃色或淺黃色。漂浮的藻絲有時也繼續(xù)保持頂端或居間生長。

生境及分布: 咸水(鹽度6‰—12‰), 著生, 生長后期或漂浮。

新種詞源學: 新種主要基于樣品采集地命名。

模式標本: QH1501。

模式標本產(chǎn)地: 青海湖(N36°38′25″, E100°27′01″)。

模式標本保存地: 酒精及甲醛標本均保存于中國科學院水生生物研究所。

樣品編號: QH1401, QH1402, QH1403, QH1404,QH1501, QH1502, QH1504和QH1505。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于SSU-LSU序列的聯(lián)合進化分析(圖 1): 序列比對產(chǎn)生了一個包含53條SSU-LSU rDNA序列的矩陣, 以細弱根枝藻Rhizoclonium subtile和分枝根枝藻R. ramosum作為外類群。序列手工校正后的矩陣長度為2230 bp。其中SSU全長1651 bp, 有保守位點(Conserved sites)1594個(96.5%), 45個簡約信息位點(Parsimony-informative sites)。LSU全長579 bp, 有保守位點496個(85.7%), 57個簡約信息位點。堿基組成分析結(jié)果顯示平均的堿基組成為A=25.3%, T=23.2%, C=22.9%, G=28.7%, A+T的含量(48.4%)略低于G+C的含量(51.6%)。

基于ITS 序列的剛毛藻科系統(tǒng)發(fā)育分析(圖 2):本研究共選取86條ITS序列用于剛毛藻科的系統(tǒng)進化分析, 選取細弱根枝藻R. subtile、厚壁根枝藻R.pachydermum和分枝根枝藻R. ramosum作為外類群。序列比對后產(chǎn)出一個長度為1484 bp的基因序列矩陣。其中有820個可變位點(Variable sites),713個簡約信息位點(Parsimony-informative sites)。堿基組成分析結(jié)果顯示平均的堿基組成為A=20.6%,T=21.9%, C=29.6%, G=27.9%, A+T的含量(42.5%)略低于G+C的含量(57.5%)。此外, 堿基的轉(zhuǎn)換/顛換偏好為0.89。

基于SSU-LSU和ITS序列所構(gòu)建的進化樹中均包含了淡水、咸水和海洋剛毛藻樣品, 這兩個系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致。其中淡水剛毛藻(以團集剛毛藻C. glomerata為代表)單獨聚于一支, 位于進化樹頂部, 與咸水剛毛藻(以散束剛毛藻C.vagabunda為代表)獨立開來。而海洋剛毛藻(以蒼白剛毛藻C. albida為代表)則位于進化樹的基部。在SSU-LSU聯(lián)合分析構(gòu)建的進化樹中, QH1401和QH1402與其他5株青海湖的剛毛藻樣品存在一定遺傳差異, 其中QH1401/QH1402的SSU序列與其他樣品SSU序列存在1個堿基的差異、LSU序列存在4個堿基的差異。所有青海湖剛毛藻樣品(QH1401、QH1402、QH1403、QH1404、QH1501、QH1502、QH1504和QH1505)的ITS序列100%一致, 無遺傳差異。3個分子標記比對結(jié)果表明青海湖剛毛藻樣品序列具有高度相似性, 堿基差異未達到種以上水平。SSU-LSU聯(lián)合分析顯示青海剛毛藻和達爾馬提亞剛毛藻C.cf.dalmatica和帕里亞迪剛毛藻C.cf.parriaudii具有較近親緣關(guān)系。青海剛毛藻與咸水剛毛藻聚為一個大支, 形成姐妹類群, 且支持率較高(1.00/88, 0.97/62)。在ITS進化樹中, 青海剛毛藻C. qinghaiensis與史氏剛毛藻C. stimpsonii有較近的親緣關(guān)系, 支持值1.00/95。綜合比較構(gòu)建的2個進化樹, ITS構(gòu)建的進化樹顯示了更大的基因序列差異, 各分支區(qū)分明顯, 支持度高。

圖 1 基于核糖體小亞基SSU和大亞基LSU聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig. 1 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of SSU and LSU of the nuclear rDNA

3 討論

3.1 青海剛毛藻和相似種的形態(tài)學比較

青海剛毛藻具有剛毛藻屬的典型特征: 即植物體通過頂端分裂或居間分裂進行生長, 具分枝, 色素體緊密排列在細胞側(cè)壁, 形成一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細胞長寬比較大, 細胞核多數(shù), 蛋白核多數(shù)[14,15]。同時青海剛毛藻也具有咸水/海水剛毛藻類群的一些獨特特征, 如一個細胞頂部有時可同時形成4—5個分枝, 淡水類群一個細胞頂部通常則僅形成2—3個分枝[14]。此外, 青海剛毛藻藻絲分枝還具有內(nèi)折或輕微彎曲現(xiàn)象, 呈鐮刀形, 該特征也出現(xiàn)于散束剛毛藻、達爾馬提亞剛毛藻和亮剛毛藻C. laetevirens等剛毛藻中[14]。但此特征并不在同一個種的所有樣品或者培養(yǎng)樣品中均出現(xiàn), 說明分枝內(nèi)折現(xiàn)象具有一定可塑性, 可能是受水流波動影響所導致。

通過和目前已知的咸水剛毛藻種進行比較, 青海剛毛藻具有一些較為細微的差異性特征。最明顯的區(qū)別是細胞直徑大小。史氏剛毛藻、散束剛毛藻、達爾馬提亞剛毛藻、束生剛毛藻C. fascicularis和亮剛毛藻等的細胞直徑均大于青海剛毛藻[14]。帕里亞迪剛毛藻植物體纖細, 主枝和分枝細胞(14—20 μm)直徑小于青海剛毛藻[14]。此外, 分布、顏色及分枝特征也存在種間差異, 史氏剛毛藻主要分布于沿海和潮間帶地區(qū), 藻絲呈絹絲狀, 分枝多偏生[16,17]。細弱剛毛藻C. gracilis主要生長與潮間帶石沼中, 藻絲亮灰綠色, 密集叢生, 有較多側(cè)生小枝[14,16,17]。

圖 2 基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig. 2 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of ITS

3.2 剛毛藻類群的系統(tǒng)進化分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹看, 剛毛藻屬目前可劃分為3大類群: 淡水類群(Freshwater group)、海洋類群(Marine water group)及咸水(過渡性)類群(Brackish water group)。海洋類群位于進化樹的基部, 淡水類群位于進化樹的頂部, 咸水支系則居于二者之間。這一進化結(jié)果進一步印證了剛毛藻是一個起源于海洋, 并逐漸向淡水過渡的類群[18—20]。Hayakawa等[8]對不同類型剛毛藻進行的鹽度適應性實驗顯示團集剛毛藻在鹽度低于10‰的水環(huán)境有較好的生長速率; 束生剛毛藻和亮剛毛藻在鹽度較高的水環(huán)境(海洋)中適宜生長, 鹽度低于16‰時, 生長速率降低;散束剛毛藻則對鹽度的耐受范圍較廣。這表明剛毛藻在進化過程中, 面對不同生境產(chǎn)生了不同類型的種類, 這些種類具有各自的生理生態(tài)適應范圍,這一范圍反過來又會影響剛毛藻的分布。因此本研究推測, 青海剛毛藻這一種類的出現(xiàn)可能是剛毛藻適應青海湖這一特殊生境的結(jié)果。

與形態(tài)特征相比, 分子數(shù)據(jù)可以較好的用于區(qū)分不同的剛毛藻類群。朱歡等[21]曾借助分子手段將淡水剛毛藻分為8個分支。盡管借助形態(tài)特征來清晰區(qū)分青海剛毛藻、史氏剛毛藻和散束剛毛藻較為困難, 但在系統(tǒng)進化樹上三者則明顯分開, 形成不同種。此外, 剛毛藻屬樣品的SSU-LSU序列相對保守, 不同種間堿基差異較小, ITS序列卻呈現(xiàn)了較大的序列差異, 說明在今后對剛毛藻進行系統(tǒng)發(fā)育分析時選擇進化速度相對較快的ITS序列可能更為有效。

基于以上形態(tài)和分子結(jié)果, 本研究建議將采集于青海湖的剛毛藻作為一個新種, 同時定名為青海剛毛藻。盡管剛毛藻類群形態(tài)具有一定可塑性, 種的鑒定相對困難, 但相信在今后更多分子數(shù)據(jù)和形態(tài)數(shù)據(jù)提供的基礎上, 剛毛藻的分類將日益清晰。

圖版Ⅰ 青海剛毛藻PlateⅠ Cladophora qinghaiensis sp. nov.