棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC3對腦缺血-再灌注損傷的影響*

王 萱，陳 莎，鄧 玲，劉京東，趙虹霞，劉勝偉，董 志

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

腦卒中是常見的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，其中缺血性腦卒中約占所有腦卒中的70%～80%［1-2］。盡管卒中后可通過快速溶栓或機(jī)械取栓及時恢復(fù)缺血區(qū)的血氧供應(yīng)，但該治療存在明確的時間窗限制，且可能會同時觸發(fā)一系列復(fù)雜的病理機(jī)制，對缺血區(qū)組織功能產(chǎn)生更有害的影響，即腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）［3-4］。

棕櫚?；且环N可逆的蛋白質(zhì)翻譯后脂質(zhì)修飾，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)功能參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（palmitoyltransferases）或相關(guān)底物蛋白酶活性的改變在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，與人類多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。多種DHHC酶的棕櫚酰化與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能和穩(wěn)定性［7］、癲癇［8］、亨廷頓蛋白的功能和轉(zhuǎn)運(yùn)［9］、阿爾茨海默?。?0］及在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中促進(jìn)端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖密切相關(guān)［11］。

棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是在蛋白S-?；D(zhuǎn)移酶（proteinS-acyltransferases，PATs）家族的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domain，CRD）中嵌入了一個含天冬氨酸-組氨酸-組氨酸-半胱氨酸（Asp-His-His-Cys）的鋅指（zinc finger）結(jié)構(gòu)域，因此也被稱作ZDHHC蛋白家族，其中大多數(shù)DHHC蛋白具有?；D(zhuǎn)移酶活性，可介導(dǎo)蛋白發(fā)生棕櫚?；?2］。ZDHHC3，也稱高爾基體特異性DHHC型鋅指蛋白（Golgi-specific DHHC type zinc finger protein，GODZ）。研究發(fā)現(xiàn)，ZDHHC3可通過棕櫚?；{(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激和衰老［12］；過表達(dá)ZDHHC3也可影響人類生長激素的正常分泌［13］；ZDHHC3可通過介導(dǎo)GABAA受體的棕櫚酰化而抑制突觸的正常形態(tài)和功能，在抑制性和興奮性突觸及其轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用［14］。但ZDHHC3在CIRI中的作用未見報道。

CIRI與許多病理生理機(jī)制有關(guān)，包括炎癥反應(yīng)、離子通道功能障礙、突觸可塑性受損和神經(jīng)元凋亡等［15］。研究發(fā)現(xiàn)，CIRI后缺血腦區(qū)神經(jīng)元的可塑性或重塑受損，大多數(shù)中風(fēng)患者都有神經(jīng)功能障礙，減輕腦缺血所致突觸結(jié)構(gòu)和功能損傷，是改善CIRI后神經(jīng)損傷的重要途徑［16］。突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）廣泛分布于腦組織中，參與突觸連接的形成和維持，在調(diào)節(jié)突觸后谷氨酸能神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用，且與損傷后神經(jīng)修復(fù)密切相關(guān)［17］。文獻(xiàn)報道，PSD95氨基端的3位和5位半胱氨酸末端均可通過可逆的巰酯鍵被棕櫚?；?8］，PSD95棕櫚?；瞧浞€(wěn)定聚集于突觸后致密物及與其他蛋白相互作用調(diào)節(jié)突觸可塑性變化的重要機(jī)制［19］。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（αamino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受體（AMPA receptor，AMPAR）是調(diào)節(jié)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)突觸功能和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究報道，AMPAR的GluA1和GluA2亞基自身有2個棕櫚?；稽c(diǎn)，可通過調(diào)節(jié)其棕櫚?；腿プ貦磅；姆€(wěn)態(tài)水平從而調(diào)控突觸可塑性［20］。因此，本研究擬通過TTC染色、RT-qPCR、HE染色、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，探討ZDHHC3與CIRI的關(guān)系及其可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

抗ZDHHC3抗體購自Santa Cruz；抗AMPAR2抗體購自Abcam；抗PSD95、β-actin、Bax和Bcl-2抗體，anti-rabbit IgG（H+L），anti-mouse IgG（H+L），以及熒光Ⅱ抗購自Proteintech；逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Monad；2×SYBR Green qPCR Master Mix購自Bimake；GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和pcDNA3.1-ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)粒購自吉瑪公司。成像儀（Bio-Rad）；正置和倒置熒光顯微鏡（Nikon）；高速低溫離心機(jī)（Thermo）；酶標(biāo)儀（BioTek）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠腦缺血-再灌注模型的建立53只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重260～280 g，6～7周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK（渝）2018-0003，隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組和大腦中動脈閉塞（middle cerebral atery occlusion，MCAO）模型組（MCAO組）。采用線栓法建立大鼠右側(cè)MCAO模型。實(shí)驗(yàn)遵循重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉后，仰臥位固定，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（inernal carotid artery，ICA）。用手術(shù)線結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈遠(yuǎn)心端后，在頸總動脈近心端處剪一切口，將線栓自頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，有阻力感即停止，固定線栓。缺血造模后90 min，拔栓，結(jié)扎血管，恢復(fù)血流，縫合皮膚，再灌注24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組同樣操作，但不插入線栓。動物蘇醒后根據(jù)改良Longa評分法觀察動物的行為表現(xiàn)并進(jìn)行行為學(xué)評分，評分在1～3分納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 腦梗死體積測定大鼠造模再灌注24 h后，采用4%水合氯醛麻醉處死，冰上斷頭取腦，-20℃放置1 h，連續(xù)冠狀切片。加入2%的TTC染液，37℃水浴避光正、反面分別染色15 min，4%多聚甲醛固定，拍照，使用Image-Pro Plus軟件計算腦梗死體積。

2.3 HE染色法腦組織經(jīng)心臟灌注后用4%多聚甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋和切片，常規(guī)HE染色后，中性樹脂封片，正置顯微鏡下觀察腦組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

2.4 RT-qPCR采用Trizol試劑，從大鼠大腦皮層、海馬和PC12細(xì)胞中提取總RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參照，在熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR。引物由上海生工公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

2.5 免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)石蠟切片在室溫下干燥10 min，4%多聚甲醛浸泡15 min，PBS洗滌后，37℃、0.3%Triton X-100通透30 min。PBS洗滌，山羊血清37℃封閉1 h。加入鼠抗ZDHHC3抗體（1∶500稀釋）、兔抗NeuN抗體（1∶100稀釋）和兔抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1∶500稀釋），4℃過夜，PBS洗滌。37℃在混合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的IgG中（1∶500稀釋）避光孵育60 min。PBS洗滌，甘油固定切片，倒置熒光顯微鏡觀察熒光圖像。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)樣品加入RIPA裂解液，同時按比例加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶2），冰上充分勻漿裂解。靜置30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，再加入上樣緩沖液。經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜7 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶4 000稀釋），室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）上顯影，運(yùn)用Image Lab軟件進(jìn)行圖像采集分析。

2.7 細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）及細(xì)胞轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞傳代培養(yǎng)密度至80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2次，更換無糖DMEM培養(yǎng)基后，放入三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（94%N2、5%CO2、1%O2、37℃）2 h后取出，換為含5%FBS、10%馬血清、5%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至普通細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育12 h和24 h后收集細(xì)胞檢測mRNA和蛋白表達(dá)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)密度達(dá)到60%～80%時，胰酶消化收集細(xì)胞并鋪至6孔板中，待完全貼壁后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6～12 h后更換無糖培養(yǎng)基進(jìn)行OGD，復(fù)氧24 h后收集細(xì)胞檢測mRNA和蛋白表達(dá)。

2.8 MTT法檢測細(xì)胞活力將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（每孔5×103個），細(xì)胞OGD/R造模24 h后，避光，每孔加入5 g/L MTT（20μL）孵育4 h；棄去孔內(nèi)液體，每孔加入200μL DMSO，搖床振蕩15 min溶解底部結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處吸光度，計算細(xì)胞活力。

2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用不含EDTA的0.25%胰酶消化各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄掉PBS，加入適量PBS重懸。參照試劑盒，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組比較采用t檢驗(yàn)；多重比較采用單因素方差分析后行Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MCAO模型建立情況

采用MCAO法建立腦缺血-再灌注模型，與sham組相比，MCAO組大鼠腦梗死體積增加，神經(jīng)行為學(xué)評分增加，肉眼觀察出現(xiàn)腦水腫（圖1A、B）。HE染色后鏡下可見sham組大鼠大腦皮層和海馬CA2區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞胞漿豐富無紅染，胞核居中，核仁清楚，細(xì)胞周圍間隙致密無水腫；MCAO組中細(xì)胞排列稀疏，間質(zhì)疏松水腫，細(xì)胞胞漿濃縮紅染，胞核皺縮，部分出現(xiàn)空泡（圖1C、D）。這些結(jié)果表示成功建立腦缺血-再灌注模型，且MCAO大鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損和細(xì)胞死亡的病理現(xiàn)象。

Figure 1.TTCstaining and HE staining were used to detect the pathological changes of MCAOrats.A：representative images of TTC staining of brain sections and quantification of infarct size（n=5）；B：neurological score were estimated after 24 h of reperfusion（n=8）；C：representative images of histopathological assay of rats in cortex（n=3，×100，×400）；D：representative images of histopathological assay of rats in hippocampal CA2 region（n=3，×100，×400）.Mean±SEM.**P＜0.01 vs sham group.圖1 TTC和HE染色檢測大腦中動脈閉塞大鼠的病理改變

2 ZDHHC3蛋白在大鼠腦組織中的定位

免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常大鼠腦組織皮層（圖2A）和海馬CA2區(qū)（圖2B），綠色熒光蛋白GFP-ZDHHC3在神經(jīng)元細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。ZDHHC3與紅色NeuN（成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物）細(xì)胞核內(nèi)重合，而與紅色GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）不重合。

3 ZDHHC3和PSD95在MCAO大鼠模型中的mRNA和蛋白表達(dá)下降

RT-qPCR結(jié)果（圖3A）顯示，與sham組相比，MCAO大鼠大腦皮層和海馬組織中ZDHHC3和PSD95的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。Western blot結(jié)果（圖3B）顯示，與sham組相比，MCAO大鼠大腦皮層和海馬組織中ZDHHC3和PSD95的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。這些結(jié)果說明，在MCAO大鼠中ZDHHC3和相關(guān)底物PSD95的mRNA和蛋白表達(dá)均較sham組顯著下降。

4 ZDHHC3和PSD95在PC12細(xì)胞OGD/R損傷后mRNA和蛋白表達(dá)下降

RT-qPCR結(jié)果（圖4A）顯示，與對照組相比，在PC12細(xì)胞中，ZDHHC3和PSD95的mRNA表達(dá)水平在復(fù)氧12 h和24 h后呈下降趨勢（P＜0.05），且復(fù)氧24 h后下降更為明顯（P＜0.01）；Western blot結(jié)果（圖4B）顯示，ZDHHC3和PSD95的蛋白表達(dá)水平在復(fù)氧24 h后降低更為明顯（P＜0.01），同時AMPAR2的蛋白水平也下降（P＜0.05或P＜0.01）。

5 轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)粒可增加PC12細(xì)胞的活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OGD復(fù)氧24 h后，細(xì)胞受到損傷，活力下降（P＜0.01）；過表達(dá)ZDHHC3后，相對OGD/R 24 h，細(xì)胞活性有所增加（P＜0.01），見圖5。

Figure 2.Double-labeled immunofluorescence of ZDHHC3 in the cortex（A）and hippocampal CA2 region（B）of the rats.ZDHHC3 colocalized with NeuN，but did not colocalize with GFAP.圖2 免疫熒光雙標(biāo)檢測ZDHHC3在大鼠腦組織中的表達(dá)位置

Figure 3.The mRNA and protein levels of ZDHHC3 and PSD95 in the cortex and hippocampus of MCAOrats.A：the mRNA levels of ZDHHC3 and PSD95 in the cortex and hippocampus of MCAO rats were decreased compared with sham group；B：the protein levels of ZDHHC3 and PSD95 were decreased in the cortex and hippocampus of MCAO rats compared with sham group.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs shamgroup.圖3 RT-qPCR和Western blot檢測ZDHHC3和PSD95在大鼠腦組織中的表達(dá)

Figure 4.The mRNA and protein levels of ZDHHC3 and PSD95 in the PC12 cells exposed to OGD/R.A：the mRNA levels of ZDHHC3 and PSD95 in the PC12 cells exposed to OGD/R for 12 h and 24 h were decreased compared with control group；B：the protein levels of ZDHHC3，PSD95 and AMPAR2 were decreased in the PC12 cells exposed to OGD/R for 12 h and 24 h compared with control group.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 RT-qPCR和Western blot檢測ZDHHC3、PSD95和AMPAR2在PC12細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 5.Effects of ZDHHC3 over-expression on the viability of PC12 cells exposed to OGD/R.Compared with OGD/Rgroup and pcDNA3.1-GFPgroup，improved viability of the PC12 cells in pcDNA3.1-ZDHHC3 group was observed.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/Rgroup.圖5 MTT檢測過表達(dá)ZDHHC3對PC12細(xì)胞活力的影響

6 轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)?？稍黾覲C12細(xì)胞PSD95和AMPAR2的蛋白水平

轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)粒后，PC12細(xì)胞中PSD95和AMPAR2的蛋白表達(dá)水平相比OGD/R組有所增加（P＜0.05），提示上調(diào)ZDHHC3的表達(dá)可影響PC12細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白PSD95和AMPAR2的表達(dá)，見圖6。

7 轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)?？蓽p少PC12細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染ZDHHC3過表達(dá)質(zhì)粒后，抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)水平相比OGD/R組有所增加（P＜0.05），Bax的蛋白表達(dá)水平相比OGD/R組有所減少（P＜0.05），見圖7。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析過表達(dá)ZDHHC3后細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，ZDHHC3過表達(dá)組凋亡細(xì)胞的比例顯著低于OGD/R組（P＜0.01），見圖8。

討 論

Figure 6.Effects of ZDHHC3 over-expression on the protein level of PSD95 and AMPAR2 in the PC12 cells exposed to OGD/R.The protein levels of ZDHHC3，PSD95 and AMPAR2 were determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/Rgroup.圖6 過表達(dá)ZDHHC3對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞PSD95和AMPAR2蛋白表達(dá)的影響

Figure 7.Effects of ZDHHC3 over-expression on apoptosis of PC12 cells exposed to OGD/R.The protein levels of Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/Rgroup.圖7 過表達(dá)ZDHHC3對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

ZDHHC3屬于DHHC蛋白家族，有研究報道，ZDHHC3導(dǎo)致AMPAR亞單位GluA1棕櫚?；?，阻礙其轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，而沉默ZDHHC3，可改善高脂飲食小鼠的突觸可塑性和記憶能力［21］。CIRI后，神經(jīng)元突觸的結(jié)構(gòu)、功能及受體轉(zhuǎn)運(yùn)也相應(yīng)受到損傷［22］，結(jié)合DHHC酶可在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用，推測ZDHHC3很可能在CIRI中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，MCAO大鼠大腦皮層和海馬組織中，以及OGD/R后PC12細(xì)胞中ZDHHC3的mRNA和蛋白水平均顯著降低。免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZDHHC3在大鼠神經(jīng)元中表達(dá)，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，表明ZDHHC3可能主要作用于神經(jīng)元從而參與調(diào)控CIRI的發(fā)生發(fā)展。

CIRI會導(dǎo)致大量神經(jīng)元損傷，調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)改變和功能障礙使突觸恢復(fù)原有的轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)交流功能，是改善CIRI后神經(jīng)損傷的關(guān)鍵［16］。AMPAR是興奮性氨基酸的特異性受體，AMPAR2亞基是其中重要組成部分，與Ca2+通透性有關(guān)，且對突觸傳遞、突觸可塑性有重要作用。PSD95為AMPAR在突觸后膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白［23］，其表達(dá)增強(qiáng)是神經(jīng)功能恢復(fù)的一種標(biāo)志［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，PSD95和AMPAR都可不同程度地發(fā)生棕櫚?；?，可介導(dǎo)突觸調(diào)控AMPAR的運(yùn)輸和功能［24-25］，且都為ZDHHC3的底物蛋白［26-27］。因此推測在CIRI后，ZDHHC3可能與PSD95轉(zhuǎn)運(yùn)AMPAR有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSD95的mRNA和蛋白在體內(nèi)、外都呈下降趨勢，MCAO大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分增加，OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)元功能受損，伴隨著大量細(xì)胞死亡，提示CIRI后神經(jīng)元受到損傷。進(jìn)一步構(gòu)建ZDHHC3過表達(dá)的PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PSD95和AMPAR2的蛋白表達(dá)相對損傷組有所增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ZDHHC3可能通過增加突觸相關(guān)蛋白PSD95和AMPAR2表達(dá)并促進(jìn)突觸轉(zhuǎn)運(yùn)而減輕CIRI。

Figure 8.The effect of ZDHHC3 over-expression on the apoptotic rate of PC12 cells.The apoptotic rate in ZDHHC3 over-expression group was higher than that in OGD/Rgroup.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/Rgroup.圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)ZDHHC3對PC12細(xì)胞凋亡率的影響

CIRI后，由細(xì)胞凋亡引起的半暗區(qū)細(xì)胞損傷是治療重點(diǎn)，所以抑制細(xì)胞凋亡是卒中治療中的神經(jīng)保護(hù)策略之一［28-29］。我們進(jìn)一步研究ZDHHC3的生物功能發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ZDHHC3可使促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZDHHC3的過表達(dá)使凋亡程度有所減輕；MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ZDHHC3的增加可一定程度上挽救細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞活力。上述結(jié)果表明，過表達(dá)ZDHHC3確實(shí)可減少缺血-再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，ZDHHC3可能通過增加PSD95的表達(dá)，參與AMPAR的轉(zhuǎn)運(yùn)，改善神經(jīng)功能，從而對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞起保護(hù)作用。ZDHHC3可能是CIRI中的潛在治療靶點(diǎn)，這為蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能是新的缺血性腦卒中治療靶點(diǎn)提供參考。但ZDHHC3在CIRI中的確切病理生理作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。