吩嗪類衍生物的抗真菌活性研究

邱麗娟，巣 雯，石安喆，閻 瀾，呂權(quán)真，姜遠(yuǎn)英 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, . 藥學(xué)院，上海 200433）

近年來，隨著免疫抑制劑的廣泛使用和介入手術(shù)的增多，深部真菌感染的發(fā)病率逐年上升。同時(shí)，手術(shù)患者的增加，住院天數(shù)的增長，也使得院內(nèi)真菌感染成為急需解決的問題。在治療真菌感染過程中長周期的給藥方式和真菌耐藥問題造成了政府和住院患者的醫(yī)療支出大幅增加，新的抗真菌藥物或者協(xié)同抗真菌藥物研究迫在眉睫。為了克服真菌的耐藥性問題，本課題組一直致力于研究藥物聯(lián)用協(xié)同抗耐藥真菌的效果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，真菌感染中最常見菌屬是念珠菌，而在念珠菌中白念珠菌的占比又高達(dá)45%～50%，因此，靶向于白念珠菌的藥物研究就顯得十分重要[1-6]。2010 年，Morales 等報(bào)道了化合物吩嗪硫酸甲酯具有抗白念珠菌被膜的活性[7]。為了進(jìn)一步獲得具有更強(qiáng)抗真菌活性的先導(dǎo)化合物，我們篩選了以吩嗪為骨架的20 余種吩嗪類衍生物，獲得了具有協(xié)同氟康唑抗真菌活性的化合物吩嗪衍生物-17，本研究為抗耐藥真菌聯(lián)合用藥提供了新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

潔凈工作臺(tái)（HPeafe-1200LC(A2)上海力申科學(xué)儀器有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（HZ-2111K-B 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；微量加樣器（Biohit）；小型冷凍離心機(jī)（HitachiCT15RE）；蒸汽滅菌鍋（KGSX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO，Japan）；多功能酶標(biāo)儀（TECAN Infinite M200）；倒置相差顯微鏡（Amersham Pharmacia AMG EVOS×1）；紫外分光光度計(jì)（Amersham Biosciences Mltrospec10）。

1.2 材料

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314 由美國Georgetown大學(xué)William A Fonzi 教授贈(zèng)送，臨床分離的耐藥白念珠菌103 和538 來自海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院皮膚科，氟康唑（FCZ）由輝瑞公司生產(chǎn)，吩嗪類化合物購自chemdiv 化合物庫，二甲基亞砜（DMSO）購自博光生物試劑有限公司，酵母提取物、甘露醇、營養(yǎng)肉湯購自BD 公司，蛋白胨、葡萄糖、瓊脂均購自上海生工生物技術(shù)有限公司，RPMI1640 購自Gibco 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 吩嗪類衍生物體外抗真菌活性與抗菌譜測定

將保存在SDA 固體培養(yǎng)皿的SC5314 單克隆菌株轉(zhuǎn)接到1 ml YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)過夜，使真菌菌株處于指數(shù)生長平臺(tái)期。①洗菌：將活化好的菌株轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管中，用無菌PBS 緩沖液洗3 次，再用1 ml PBS 重懸。②調(diào)節(jié)濃度：用RPMI1640 稀釋菌液100 倍，使其濃度為（1～5）×106CFU/ml。再用RPMI1640 稀釋1 000倍，使菌終濃度（1～5）×103CFU/ml。③制備藥敏實(shí)驗(yàn)板：取一塊96 孔板，第1 列加入100 μl RPMI 1640 液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照；第2 列加200 μl 上述菌液，第3～12 列分別加入100 μl 上述菌液，第2 列加吩嗪類衍生物使其終濃度為64 μg/ml，2～11 列進(jìn)行倍比稀釋，使得藥物終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每個(gè)藥都加2 個(gè)復(fù)孔（2 行），以減少實(shí)驗(yàn)誤差，鋪好藥和菌的96 孔板用封條封閉，于30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，用酶標(biāo)儀在λ=630 nm 測吸光度（A）值，計(jì)算MIC80值。

2.2 吩嗪類衍生物協(xié)同氟康唑的體外抗真菌活性和抗菌譜的研究

菌株活化、洗菌和調(diào)菌濃度同前所述，取一塊96 孔板，第1 列加入100 μl RPMI1640/YEPD 培養(yǎng)基做空白對(duì)照；第12 列加入100 μl 上述菌液做陽性對(duì)照；剩余菌液加入適量氟康唑，使得氟康唑終濃度為2 μg/ml，第2 列加入該配制好的菌液200 μl，第3～11 列加入該配制好的菌液100 μl，第2 列再加入吩嗪類衍生物使其終濃度為64 μg/ml，2～11 列進(jìn)行倍比稀釋，使得藥物終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每種藥都加2 個(gè)復(fù)孔（2 行），以減少實(shí)驗(yàn)誤差，將鋪好藥和菌的96 孔板用封條封閉，于30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，用酶標(biāo)儀在λ=630 nm 處測A值，計(jì)算最低抑菌濃度（MIC80）和協(xié)同指數(shù)（FICI）。

除了用上述耐藥白念珠菌103 實(shí)驗(yàn)外，再更換菌株為538，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 吩嗪衍生物-17 與氟康唑合用對(duì)白念珠菌菌絲形成能力的影響

過夜活化的白念珠菌SC5314 分別用Spider培養(yǎng)液和RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋1 000 倍，分別加藥使吩嗪衍生物-17 終濃度為4 μg/ml、FCZ 的終濃度為4 μg/ml 以及吩嗪衍生物-17 與FCZ 的合用（濃度與單藥相同），空白對(duì)照加入同體積的DMSO，充分混勻，轉(zhuǎn)移至12 孔板中，37 ℃，靜置培養(yǎng)3 h，倒置顯微鏡觀察菌絲形態(tài)。

3 結(jié)果與討論

3.1 吩嗪類化合物體外抗真菌活性與抗菌譜的測定

通過對(duì)吩嗪類24 種衍生物的體外抗真菌活性研究發(fā)現(xiàn)，吩嗪類化合物單用對(duì)白念珠菌沒有抗真菌活性，其MIC80均＞128 μg/ml。在RPMI1640 培養(yǎng)液中，采用臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌103 和538（氟康唑單用時(shí)，MIC80＞32 μg/ml），考察吩嗪類化合物協(xié)同氟康唑的抗真菌活性。結(jié)果顯示，當(dāng)吩嗪類化合物與2 μg/ml 的氟康唑合用時(shí)，0.25～0.5 μg/ml 的吩嗪衍生物-12、0.125 μg/ml 的吩嗪衍生物-17、1～2 μg/ml 的吩嗪衍生物-18 協(xié)同氟康唑后有明顯的抗耐藥白念珠菌的活性，結(jié)果見表1。而后我們采用棋盤式微量液基稀釋法，進(jìn)一步考察了氟康唑和吩嗪衍生物-12、吩嗪衍生物-17、吩嗪衍生物-18 合用時(shí)的最低濃度，結(jié)果顯示吩嗪衍生物-17 與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌菌效果最強(qiáng)，0.062 5 μg/ml 的吩嗪衍生物-17 與1 μg/ml 的氟康唑即可完全抑制耐藥白念珠菌的生長，協(xié)同指數(shù)FICI＜0.5，說明與氟康唑具有明顯的協(xié)同作用（表2）。

表1 吩嗪類衍生物（2 μg/ml）協(xié)同氟康唑?qū)Ψ颠蚰退幇啄钪榫?03MIC80 值的測定結(jié)果

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

表2 吩嗪類衍生物與氟康唑單用及合用對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌538 的MIC80 值和FICI 值的測定結(jié)果

3.2 吩嗪類衍生物-17 與氟康唑合用抑制白念珠菌菌絲形成

為了進(jìn)一步考察吩嗪類衍生物-17 的體外抗菌活性，我們考察了其對(duì)菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明，在RPMI1640 誘導(dǎo)菌絲形成的過程中，吩嗪衍生物-17 與氟康唑合用對(duì)菌絲的生長抑制不明顯，但在Spider 培養(yǎng)基中，兩藥合用對(duì)菌絲的形成有明顯抑制作用（圖1）。

圖1 吩嗪類衍生物-17 抑制白念珠菌的菌絲形成

4 討論

近年來，隨著免疫抑制劑的廣泛用、手術(shù)介入和免疫缺陷患者的增多，系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率逐年攀升。但抗真菌藥物的研發(fā)進(jìn)展緩慢，現(xiàn)有的幾類抗真菌藥物在長期使用后也逐漸出現(xiàn)了耐藥性。為克服臨床真菌感染的問題，研發(fā)新的抗真菌藥物意義重大。本課題組長期致力于協(xié)同抗耐藥真菌研究，期望篩選獲得具有協(xié)同抗耐藥真菌活性的化合物，進(jìn)而達(dá)到降低給藥劑量，提高抗菌能力的目的，為臨床抗真菌治療提供新的策略。本研究前期通過體外篩選吩嗪類化合物的抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)吩嗪類化合物單藥使用時(shí)沒有抗真菌活性，但是吩嗪衍生物-12、-17、-18 與氟康唑合用有顯著的協(xié)同抗真菌活性，這一研究結(jié)果有望為抗真菌藥物研發(fā)提供新的思路。該研究尚未探討吩嗪類衍生物的協(xié)同抗耐藥真菌機(jī)制，后續(xù)仍需進(jìn)一步深入研究。