重組酶聚合酶擴增檢測產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的微流控芯片技術(shù)

范一靈，王淑娟，李瓊瓊，胡 穎，宋明輝，秦 峰,4，劉 浩，楊美成,*

（1.國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術(shù)重點實驗室，上海市食品藥品檢驗研究院，上海 201203；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；3.遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563006；4.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200438）

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（Shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）是一類可引起人類腹瀉、腸出血、溶血性尿毒綜合征、腎衰竭、溶血性貧血以及死亡的食源性致病微生物[1]，可存在于水體、植物、動物尤其是反芻動物體內(nèi)[2]。食品中低于100 CFU的STEC菌體就可能導(dǎo)致人類患病[3]。STEC共有超400 種血清型[4]，在非O157:H7血清型的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（Non-O157 STEC）中，有6 種被認為是檢出率最高、危害較大的菌株，分別是O26（22%）、O111（16%）、O103（12%）、O121（8%）、O45（7%）和O145（5%）[5-6]。美國疾控中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2016年美國有5 441 例經(jīng)確認的STEC感染事件[7]，預(yù)估有超過26萬 名患者，導(dǎo)致30 人死亡[8]。

目前，檢測STEC的主要分子靶點是編碼志賀毒素的stx基因。該基因主要分為stx1和stx2基因兩類[9-10]。其中，stx1基因有3 個亞型，分別為stx1a、stx1c、stx1d；而stx2基因的亞型較多，常見的亞型有stx2a到stx2g共7 種亞型[9,11]。國際上主要采用實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）[12-14]對其進行檢測，其中使用較廣的國際標(biāo)準化組織（International Organization for Standardization，ISO）和美國農(nóng)業(yè)部（United States Department of Agriculture，USDA）方法也采用該技術(shù)對疑似含STEC的增菌培養(yǎng)物進行初篩[15-16]。然而，real-time PCR方法需要溫度在50～100 ℃間不停變化，對相關(guān)檢測設(shè)備要求較高，無法便攜攜帶，較難滿足基層實驗室和現(xiàn)場快速檢測的需求。

近年來，以恒溫方式擴增目標(biāo)核酸的方法被逐步應(yīng)用于微生物檢測領(lǐng)域，給致病菌的核酸快速檢測提供了更多選擇。如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[17]、基于核酸序列的擴增技術(shù)、解旋酶依賴等溫擴增技術(shù)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）和滾環(huán)擴增技術(shù)等[18-19]。其中，RPA技術(shù)可在較低溫度（38～42 ℃）擴增目標(biāo)核酸，反應(yīng)過程中無需高溫解開DNA雙鏈，引物設(shè)計相對簡單，擴增速度快、準確度高[20]，對設(shè)備要求低，可用于現(xiàn)場檢測[21]。微流控芯片技術(shù)是在特殊材質(zhì)的芯片上使用微米甚至納米級微管道將樣品制備、分散和檢測等步驟進行集成的技術(shù)[22]。因其具有微型化、集成化的特點，適用于微量的分子檢測，可提高檢測效率，節(jié)省試劑成本[23-24]。離心式微流控芯片借助離心力將芯片中的液體經(jīng)微孔道分散達到檢測目的，擺脫了傳統(tǒng)微流控芯片對加樣器和壓力泵的限制，操作簡單，容易實現(xiàn)高通量和便攜式檢測[25-26]。

本研究通過對stx基因亞型序列的分析，設(shè)計檢測STEC的熒光RPA引物與探針組合，以集成化圓盤式微流控芯片為載體，開發(fā)特異性的檢測方法。通過考察方法的包容性、排他性、靈敏度和準確性等指標(biāo)，實現(xiàn)對食品中STEC菌株的高通量、快速篩查和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗所用測試菌株共40 株（表1）。其中，15 株Non-O157 STEC和1 株E. coliO157:H7菌株來自中國食品藥品檢定研究院（標(biāo)注為FC和ST編號菌株），采用Scheutz等[11]方法對stx基因進行分型確認；3 株E. coliO157:H7標(biāo)準菌株、7 株普通E. coli標(biāo)準菌株和14 株其他微生物菌種由上海市食品藥品檢驗研究院提供。14 株其他微生物菌種包括：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaCMCC 10104）、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphiB CMCC 50094）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisCMCC 63501）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneriCMCC 51572）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazaliiATCC 29544）、神戶腸桿菌（E. kobei）、液化沙雷氏菌（Serratia liquefasciens）、豪氏變形桿菌（Proteus hauseri）、蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）、普通變形桿菌（Proteus vulgari）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）和布氏檸檬酸桿菌（C. braakii）各1 株，非標(biāo)準菌株分離于市售牛肉樣品。

1.1.2 試劑

胰酪大豆胨液體（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基德國Merck公司；細菌基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；基礎(chǔ)型DNA恒溫快速擴增試劑盒、熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒 安普未來生物科技有限公司；柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；GelRed核酸染色液 美國Biotium公司；DL2000 DNA Marker、PCR預(yù)混液 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEC 2 Compact全自動生化鑒定儀 法國生物梅里埃公司；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀德國Eppendorf公司；VERITI PCR擴增儀 美國Applied Biosystems公司；GelDoc XR紫外成像儀 美國Bio-Rad公司；480II熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；SX-MA2000 plus芯片檢測儀 上海速芯生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種復(fù)蘇與核酸的提取

將微生物菌種接種于TSB培養(yǎng)基中，置（36±1）℃過夜培養(yǎng)。采用生化鑒定儀確認。取TSB增菌培養(yǎng)物1 mL至離心管中，選用細菌基因組提取試劑盒，按說明書操作，最后將提取的基因組核酸溶解于三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（tris-EDTA buffer solution，TE）緩沖液100 μL，置-20 ℃保存。用核酸蛋白定量檢測儀測定核酸濃度。

表1 實驗所用菌株及stx基因的real-time PCR和熒光RPA檢測結(jié)果Table 1 Bacterial strains used in this study and results of detection of their stx genes using real-time PCR and fluorescence RPA

續(xù)表1

1.3.2 引物和探針的設(shè)計及核酸擴增

從GeneBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中獲得stx1和stx2基因亞型的核酸序列，包含stx1基因亞型3 種（stx1a、stx1c、stx1d）和stx2基因亞型7 種（stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g）。將上述序列采用MEGA X軟件進行比對，尋找相對保守區(qū)域，根據(jù)序列比對信息，標(biāo)出簡并堿基。采用Primer Premier 5.0軟件按TwistDx公司RPA設(shè)計原則分別設(shè)計上下游引物和探針（表2）。其中，引物長度一般在25～35 bp，GC含量在30%～70%之間。探針序列不與引物識別位點重疊，長度一般為46～52 bp。引物和探針序列要避免出現(xiàn)回文結(jié)構(gòu)、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)重復(fù)堿基。此外，核酸擴增片段也應(yīng)盡量避免形成二級結(jié)構(gòu)，擴增片段長度一般在150～300 bp之間。引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

普通RPA反應(yīng)選用基礎(chǔ)型DNA恒溫快速擴增試劑盒。在干粉反應(yīng)管中加入29.4 μL反應(yīng)預(yù)混液A，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板1.5 μL，加水至47.5 μL，最后加入緩沖液B（含280 mmol/L醋酸鎂溶液）2.5 μL配成50 μL反應(yīng)體系。stx1和stx2基因的檢測反應(yīng)體系均分別獨立配制。充分混勻，置于PCR儀中39 ℃恒溫反應(yīng)20 min。用柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴增產(chǎn)物。取5 μL已純化產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用GelRed溶液10 μg/mL浸泡染色10 min，置紫外成像儀內(nèi)觀察。實驗中在獨立的實驗區(qū)域進行產(chǎn)物純化和電泳，防止擴增產(chǎn)物氣溶膠的污染。

熒光RPA反應(yīng)選用熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒。在干粉反應(yīng)管中加入29.5 μL反應(yīng)預(yù)混液A，制成完整預(yù)混液A。取2.95 μL完整預(yù)混液A，上下游引物和探針（10 μmol/L）各0.1 μL，DNA模板1.5 μL，最后加入緩沖液B（含280 mmol/L醋酸鎂溶液）0.25 μL，配成5 μL反應(yīng)體系。充分混勻，置real-time PCR儀中39 ℃恒溫反應(yīng)20 min，每30 s采集一次熒光信號，共40 個循環(huán)。stx1和stx2基因的檢測反應(yīng)體系均分別獨立配制。

STEC菌種的stx基因攜帶情況按美國農(nóng)業(yè)部2021年更新的微生物實驗室技術(shù)指南5C.01[27]中real-time PCR方法進行驗證。反應(yīng)體系為1×PCR反應(yīng)預(yù)混液，上下游引物各1.25 μmol/L，stx1和stx2基因探針各0.25 μmol/L，DNA模板5 μL，加水配成25 μL反應(yīng)體系。stx1和stx2基因的檢測反應(yīng)體系均分別獨立配制。反應(yīng)程序為95 ℃加熱3 min；95 ℃退火15 s，59 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)。

表2 實驗所用的引物和探針核酸序列Table 2 Nucleic acid sequences of primers and probes used in this study

1.3.3 RPA檢測方法的評價

將檢測stx1和stx2基因的備選RPA反應(yīng)的上下游引物分別進行兩兩組合，以E. coliCICC 21530基因組核酸為模板，按普通RPA反應(yīng)條件篩選適宜的RPA擴增引物。選擇擴增效率較高，且產(chǎn)物條帶單一的引物組合分別與相應(yīng)探針配對，用表1所列菌種的基因組核酸評價熒光RPA方法的包容性和排他性。將E. coliCICC 21530的基因組核酸進行10 倍梯度稀釋，質(zhì)量濃度分別為1.28×105、1.28×104、1.28×103、1.28×102、1.28×101、1.28、1.28×10-1pg/μL和1.28×10-2pg/μL，將E. coliCICC 21530的TSB新鮮培養(yǎng)物進行10 倍梯度稀釋，菌體濃度分別為9.5×107、9.5×106、9.5×105、9.5×104、9.5×103、9.5×102、9.5×101CFU/mL和9.5 CFU/mL，分別用于評價熒光RPA方法的檢測靈敏度。

1.3.4 熒光RPA微流控芯片方法的評價

實驗所用圓盤離心式微流控芯片組件由聚碳酸酯材料經(jīng)微注塑工藝成圓盤式結(jié)構(gòu)[28]，每張芯片有8 套相同的微流控結(jié)構(gòu)區(qū)，每個結(jié)構(gòu)區(qū)分別有1 個加樣區(qū)、1 個液體分配區(qū)和4 個獨立反應(yīng)區(qū)，可同時進行32 個反應(yīng)。將完整反應(yīng)預(yù)混液A、上下游引物和探針按5 μL熒光RPA反應(yīng)體系預(yù)先加入芯片反應(yīng)區(qū)中，每個結(jié)構(gòu)區(qū)中對stx1和stx2基因分別做2 個重復(fù)測試，風(fēng)干約15 min后用塑封膜密封，儲存于-20 ℃保存?zhèn)溆?。測試時，每個加樣區(qū)按4 個5 μL熒光RPA反應(yīng)液的反應(yīng)體系，將核酸模板與緩沖液B 1 μL混合，加水使混合液體積為20 μL。將待測混合液加入芯片中，經(jīng)1 500 r/min離心使液體進入分配區(qū)，被定量分成4等份，再將芯片經(jīng)4 500 r/min離心使液體進入反應(yīng)區(qū)，在芯片檢測儀內(nèi)維持39 ℃孵育30 min，每30 s檢測一次熒光信號。將E. coliCICC 21530的基因組核酸及其新鮮培養(yǎng)的菌體分別進行10 倍梯度稀釋，用以評價熒光RPA微流控芯片方法的檢測靈敏度。

1.3.5 人工污染樣品檢測

取市售牛肉餡樣品，混勻后分成25 份，每份約25 g。隨機取1 份作對照，其余樣品分為3 組，分別加入E. coliCICC 21530的菌懸液，由于計數(shù)結(jié)果的隨機性，每組樣品的接種量分別約為10、1 CFU/25 g和小于1 CFU/25 g。按照GB 4789.6—2016《食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》的方法進行增菌培養(yǎng)。分別取腸道增菌肉湯培養(yǎng)物1 mL，室溫、500 r/min離心1 min；取上清液至新的無菌離心管中，室溫、10 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加入500 μL生理鹽水，重懸，室溫、10 000 r/min離心3 min；棄去上清液，加入TE緩沖液100 μL，重懸；99 ℃加熱15 min，置室溫冷卻2 min，室溫、13 000 r/min離心4 min；取上清液即為樣品基因組核酸溶液。剩余的肉湯培養(yǎng)物按國標(biāo)方法檢測。將國標(biāo)方法與熒光RPA微流控芯片方法的檢測結(jié)果按ISO 16140-2: 2016中替代方法評價的方式，計算方法的相對正確度和相對檢出水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株stx基因型的確認

采用USDA公布的real-time PCR方法對實驗所用菌種stx1和stx2基因進行確認（表2）。real-time PCR對STEC菌株的檢測結(jié)果與已知的菌種信息一致，其他非STEC菌種的檢測結(jié)果均為陰性。待測菌種可用于后續(xù)方法的評價過程。

2.2 普通RPA擴增引物的篩選

以MEGA X軟件分析stx1和stx2基因序列，在目標(biāo)基因序列中確定上下游引物的結(jié)合位點，預(yù)測擴增產(chǎn)物大?。ū?）。比較普通RPA反應(yīng)的擴增產(chǎn)物電泳條帶大小與預(yù)測產(chǎn)物長度大小，結(jié)合RPA終產(chǎn)物濃度的高低（即電泳條帶明亮度），選擇stx1-F1與stx1-R1引物組合用于檢測stx1基因（圖1A），選用stx2-F2與stx2-R2引物組合用于檢測stx2基因（圖1B）。

表3 不同引物組合預(yù)測的普通RPA反應(yīng)擴增產(chǎn)物大小Table 3 Predicted sizes of conventional RPA-amplified products using different primer combinations bp

圖1 不同引物組合的普通RPA反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of conventional RPA products of stx gene using different primer combinations

2.3 熒光RPA方法的包容性和排他性

采用熒光RPA方法檢測試驗菌株基因組核酸，目標(biāo)菌stx1和stx2基因的判斷與菌種確認的基因信息一致，非目標(biāo)菌基因組核酸測試結(jié)果均為陰性（表1）。熒光RPA方法可在7 種常見的STEC血清型（O157、O26、O45、O103、O111、O145、O121）中有效檢測9 種stx基因亞型，分別為stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g基因，方法包容性和排他性均為100%。

2.4 熒光RPA方法的靈敏度

如圖2所示，在20 min內(nèi)分別以引物stx1-F1與stx1-R1組合（圖2a）和引物stx2-F2與stx2-R2組合（圖2b）檢測STEC基因組核酸的靈敏度均為12.8 pg/μL。

圖2 熒光RPA檢測E. coli CICC 21530基因組核酸靈敏度實驗Fig.2 Sensitivity of fluorescence RPA method for detecting genomic nucleic acid in E. coli CICC 21530

對E. coliCICC 21530的TSB培養(yǎng)物進行10 倍梯度系列稀釋，用以考察熒光RPA方法檢測菌體細胞的靈敏度。熒光RPA方法可在20 min內(nèi)以引物stx1-F1與stx1-R1組合檢測STEC菌體的靈敏度為9.5×103CFU/mL（圖3a）；雖然引物stx2-F2與stx2-R2組合在9.5×102CFU/mL時檢測到陽性擴增信號，但出現(xiàn)信號的循環(huán)數(shù)偏大，熒光信號與背景信號差異偏小，因此，stx2-F2與stx2-R2引物組合檢測STEC菌體的靈敏度為9.5×103CFU/mL（圖3b）。

圖3 熒光RPA檢測E. coli CICC 21530菌體的靈敏度實驗Fig.3 Sensitivity of fluorescence RPA method for detecting E. coli CICC 21530 cells

2.5 熒光RPA微流控芯片檢測靈敏度

采用圓盤式微流控芯片對E. coliCICC 21530的TSB培養(yǎng)物的10 倍梯度系列稀釋液進行檢測。引物stx1-F1與stx1-R1組合可檢測的菌體靈敏度為9.5×104CFU/mL（圖4a）；引物stx2-F2與stx2-R2組合可檢測菌體靈敏度為9.5×103CFU/mL（圖4b）。在相同核酸上樣量的情況下，微流控芯片檢測stx1基因的靈敏度有所降低，對stx2基因的檢測靈敏度維持不變。但由于微流控芯片體系采用反應(yīng)體系預(yù)置干燥形式，最大可將核酸上樣量增加至4.75 μL，可提高檢測的靈敏度。

圖4 熒光RPA微流控芯片檢測E. coli CICC 21530菌體的靈敏度實驗Fig.4 Sensitivity of fluorescence RPA-integrating microfluidic chip for detecting E. coli CICC 21530 cells

2.6 人工污染樣品檢測

采用熒光RPA微流控芯片法（替代方法）和GB 4789.6—2016（參考方法）分別對3 組不同污染程度的24 份人工污染樣品和1 份陰性對照樣品進行檢測，替代方法和參考方法所得檢測結(jié)果均一致，其中，對污染水平為10 CFU/25 g和1 CFU/25 g的樣品檢測結(jié)果均為陽性；在污染水平低于1 CFU/25 g的樣品中，有2 份檢測結(jié)果為陰性，其余6 份樣品檢測結(jié)果為陽性，該濃度陰性樣品占比為25%（2/8）。將檢測結(jié)果按ISO 16140-2:2016中參考方法和替代方法的實驗結(jié)果進行匯總（表4）。按ISO 16140標(biāo)準計算熒光RPA微流控芯片法的相對正確度和相對檢出水平均為100%，方法未見假陽性和假陰性結(jié)果。

表4 熒光RPA微流控芯片法和GB 4789.6—2016方法的實驗結(jié)果比較Table 4 Comparison of results for artificially contaminated samples detected by fluorescence RPA-integrating microfluidic chip and national standard method (GB 4789.6-2016)

3 討論與結(jié)論

RPA技術(shù)是等溫擴增技術(shù)之一，由于其反應(yīng)溫度低，無需復(fù)雜加熱設(shè)備，反應(yīng)時間短，具有良好的靈敏度和特異性[21]，適合與微流控芯片技術(shù)結(jié)合開發(fā)微生物快速檢驗方法[18-19]。本研究采用兩段離心式微流控芯片的管路設(shè)計，將反應(yīng)預(yù)混液提前預(yù)置在芯片中。與傳統(tǒng)檢測方法相比，操作者省去了復(fù)雜的體系配制，只需一步加樣混合，便可同時進行多平行和多靶點測試，反應(yīng)在鎂離子存在的條件下，在39 ℃迅速啟動，20 min內(nèi)實現(xiàn)高通量和便捷化的測試結(jié)果。雖然，微流控技術(shù)受反應(yīng)體積和液體殘留等影響會略微降低熒光RPA方法的檢測靈敏度，但反應(yīng)體積可由RPA反應(yīng)標(biāo)準方法的50 μL減少至5 μL，極大地降低試劑成本的同時，可檢測約10～100 CFU/μL的目標(biāo)微生物。由于芯片中預(yù)置體系是脫水狀態(tài)，加樣時可通過增加核酸模板的量提升測試的檢測靈敏度。

stx基因是STEC菌株最主要的毒力編碼基因，由可高度轉(zhuǎn)移的遺傳元件stx噬菌體編碼，該噬菌體的基因水平轉(zhuǎn)移，可能導(dǎo)致stx基因在大腸埃希菌中的傳播[29]，并導(dǎo)致新基因亞型出現(xiàn)[30]，也是STEC菌株成為日益嚴重的食品安全問題的原因之一[31]。stx基因的突變和重組現(xiàn)象較普遍[11]，尤其是stx2基因，除stx2a到stx2g亞型外，新的亞型也不斷被發(fā)現(xiàn)，如stx2h[32]、stx2i[33]和stx2k等[34]。目前，還未見有快速檢測方法可以覆蓋所有stx基因亞型，USDA[15]和ISO[16]的官方標(biāo)準檢測方法也漏檢stx2f基因亞型。stx2f基因在核酸序列上與其他stx2基因序列差異較大[11]，為檢測stx2f基因還需額外設(shè)計引物和探針。本研究所用方法可檢測stx2a至stx2g基因亞型（除stx2f基因外），檢測范圍與USDA方法相同。雖然，也有研究人員開發(fā)了檢測STEC的RPA方法[35]，通過MEGA X比較其引物序列，該序列缺少簡并堿基，與stx2b、stx2e、stx2f、stx2g等基因亞型無法完全匹配，測試數(shù)據(jù)缺少可檢測基因亞型的確認。

在檢測食品樣品中，食物基質(zhì)顆粒物可能會阻塞微流控芯片的微孔道，影響檢測結(jié)果。為了去除食品基質(zhì)干擾，在樣品基因組核酸提取過程中，先通過低速離心的方式去除較大顆粒物，在加熱釋放核酸后采用高速離心分離大多數(shù)不可溶雜質(zhì)，減少上樣過程中的顆粒干擾。此外，在核酸提取過程中的清洗離心步驟有助于去除大部分的脂肪和蛋白成分，有助于降低其對酶反應(yīng)效率和熒光信號探測的影響。

本研究結(jié)合了熒光RPA技術(shù)和離心式微流控芯片技術(shù)，以預(yù)置的熒光RPA反應(yīng)體系可簡便、快速地檢測食品中STEC菌株。該方法特異性高、準確度好，對儀器設(shè)備要求低，且具備高通量檢測能力。