基于UPLC-QqQ-MS/MS同步檢測熱加工食品中典型晚期糖基化終末產(chǎn)物

程威威，王 霞，張忠飛，劉國琴，陳 峰，鄭家榮,*

（1.深圳大學(xué)高等研究院，深圳食品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展研究院，深圳市海洋微生物組工程重點實驗室，廣東 深圳 518060；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是食品加工過程中伴生化學(xué)危害物，主要是還原糖與蛋白質(zhì)的自由氨基或與游離氨基酸經(jīng)美拉德反應(yīng)等途徑形成的一系列穩(wěn)定聚合產(chǎn)物的總稱，其中羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）和羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL）是2 個典型的AGEs，其含量常被用作食品中AGEs生成的指標(biāo)[1-6]。食源性AGEs能夠進(jìn)入人體血液循環(huán)，與人體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，這也是導(dǎo)致一系列慢性疾病發(fā)生及加重的關(guān)鍵因素，包括糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[7-10]。因此，近年來針對食品中AGEs的研究越來越受到關(guān)注和重視。

富含碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的食品在熱加工過程中容易產(chǎn)生AGEs，如烘焙食品和煎炸食品[11-14]，是膳食中公認(rèn)的AGEs的重要來源[15]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)嬰兒食品如配方奶粉中也存在一定量的AGEs[16-18]。目前，我國尚未制定食品中AGEs檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，也無食品中AGEs的限量標(biāo)準(zhǔn)。原因可能是食品基質(zhì)組分復(fù)雜，且差異較大，導(dǎo)致存在不同的基質(zhì)效應(yīng)，難以建立統(tǒng)一有效的前處理和定量方法，這不利于不同類型食品中AGEs的含量比較。

建立不同食品中高效、準(zhǔn)確、低成本的AGEs檢測以及鑒定的通用方法，是工業(yè)抑制食品生產(chǎn)加工中AGEs生成的重要基礎(chǔ)。目前，已報道的食品中CML和CEL同步檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[19-24]。ELISA法需要特定的抗體，并且樣品的基質(zhì)效應(yīng)對方法靈敏度的影響很大，故可能導(dǎo)致較大的誤差。HPLC和GC-MS法通常需要柱前衍生化，可操作性差且檢測靈敏度較低。HPLC-MS法具有操作簡單，可重復(fù)性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點，故通常用于測定CML和CEL含量。

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）技術(shù)是在HPLC基礎(chǔ)上，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積（死體積）及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，故分離度更好，檢測速度快，消耗溶劑少。三重四極桿質(zhì)譜在保留四極桿質(zhì)譜原有定量能力強(qiáng)的特點上，提供了串級功能，加強(qiáng)了質(zhì)譜的定性能力，信噪比更優(yōu)。目前超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS）技術(shù)已應(yīng)用于食品中組分和外源物含量分析[25-27]，但其對食品中CML和CEL的檢測鮮有報道。因此，本研究旨在基于UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)，建立適用于不同熱加工食品中CML和CEL含量同步檢測的通用方法，并進(jìn)行方法學(xué)評價，為食品中CML和CEL測定方法的國家標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蓮蓉月餅、雞仔餅、曲奇、杏仁餅、老婆餅、面包、嬰兒餅干、嬰兒肉松、嬰兒米餅、方便面、油條均購自深圳市內(nèi)各大型超市，雞米花、薯條購自某快餐連鎖品牌店。

CML標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、CEL標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 加拿大TRC公司；硼氫化鈉（純度≥98%） 廣東西隴科學(xué)股份有限公司；四硼酸鈉·十水合物（純度≥99.9%）、鹽酸、正己烷、氯仿、乙腈、甲醇、氨水、氫氧化鈉（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純）上海賽默飛世爾科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（配有電噴霧離子源、色譜工作站和溫控柱溫箱）、Oasis MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；Heraeus Multifuge XIR型高性能通用臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；Scientz-10N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q IQ7005超純水純化系統(tǒng) 美國Millipore公司；QUINTIX65-1CN型分析天平 德國Startorius公司；WD-12型水浴氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；Vortex-Genie2型渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱量10.0 mg CML和CEL分別溶于10 mL超純水中，配制質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20 ℃保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液按一定比例稀釋，配制質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液，置于-4 ℃密封保存。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將工作液按比例稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為0.100、0.250、0.500、2.00、10.0、25.0、50.0、100、200、500 ng/mL的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)樣品類型選取適合的空白基質(zhì)，向空白基質(zhì)樣品中分別添加上述已配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理，得到0.100～500 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，然后吸取部分轉(zhuǎn)入液相色譜進(jìn)樣瓶。

1.3.2 樣品前處理

樣品冷凍干燥后用料理機(jī)研碎，置于-20 ℃保存。準(zhǔn)確稱量0.500 g樣品粉末于50 mL離心管中。向樣品中加入5 mL正己烷，振蕩3 min混勻后，8 000 r/min離心6 min，棄去溶劑，重復(fù)以上脫脂步驟1 次后，45 ℃氮吹干至樣品恢復(fù)粉末狀。向樣品中加入5 mL硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.2）和2.5 mL硼氫化鈉溶液（1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液），在4 ℃冰箱中還原過夜。然后向還原液中加入4 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混勻，5 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，轉(zhuǎn)移沉淀至消解管中，用氮氣室溫吹掃1 min，加入5 mL 6 mol/L的鹽酸，110 ℃水解24 h。水解液冷卻至室溫，用定性濾紙過濾后，純水定容至25 mL，吸取2 mL濾液，冷凍干燥，再用2 mL純水復(fù)溶。

分別用3 mL甲醇和3 mL水活化Waters Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60 mg），取1 mL上述溶液作為上樣液，再用3 mL水，3 mL甲醇淋洗，最后用5 mL氨化甲醇（5∶95，V/V）洗脫。將洗脫液在50 ℃氮吹干，復(fù)溶于400 μL 2%乙腈溶液中，取50 μL稀釋至1 mL，在13 000 r/min離心6 min后，上清液供UPLC-QqQ-MS/MS測試。

1.3.3 UPLC條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動相A為乙腈，流動相B為水（含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨），梯度洗脫程序如表1所示。流速0.1 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 MS條件

電噴霧離子源，正離子模式；載氣：高純氦（純度≥99.999%）；毛細(xì)管電壓3.5 kV；脫溶劑溫度400 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；錐孔氣流量150 L/h；離子源溫度120 ℃；碰撞氣流量0.17 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測模式。

CML：定量離子：m/z205＞84，錐孔電壓38 V，碰撞能量16 eV；定性離子：m/z205＞130，錐孔電壓38 V，碰撞能量10 eV；

CEL：定量離子：m/z219＞84，錐孔電壓24 V，碰撞能量20 eV；定性離子：m/z219＞130，錐孔電壓24 V，碰撞能量12 eV。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗平行測定至少3 次，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以表示，由Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

CML和CEL分析的樣品預(yù)處理是基于硼氫化鈉還原-酸水解蛋白-固相萃取法進(jìn)行。硼氫化鈉還原步驟的目的是防止樣品酸處理過程中Amadori產(chǎn)物生成新的CML和CEL，導(dǎo)致樣品中CML和CEL檢測含量高于真實值[28]。因此首先對脫脂樣品進(jìn)行硼氫化鈉（1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液）過夜還原處理，然后用氯仿-甲醇混合溶劑沉淀蛋白，棄去上清液，對蛋白沉淀物進(jìn)行酸水解，最后利用SPE柱對水解液進(jìn)行分離純化，通過比較回收率得到最佳的SPE柱為Waters Oasis MCX SPE前處理小柱（3 mL/60 mg）。經(jīng)優(yōu)化后最終確定的樣品前處理條件見1.3.2節(jié)。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

CML和CEL極性較強(qiáng)，很難在普通的反相色譜柱上進(jìn)行保留。前期的報道多采用C18反相硅膠柱對CML和CEL進(jìn)行分離，以九氟戊酸為洗脫液。然而，九氟戊酸能使流動相的pH值偏低（＜2.0），導(dǎo)致色譜柱的損傷[29]。為了避免九氟戊酸的使用，本研究選擇極性修飾十八烷基硅烷健合硅膠色譜柱（Waters ACQUITY HSS T3）對樣品中CML和CEL進(jìn)行分離，并優(yōu)化UPLC條件。

在多反應(yīng)監(jiān)測模式下對CML和CEL的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。采用電噴霧正離子模式對CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，得到一級全掃描質(zhì)譜圖，以兩者的分子離子峰[M+H]+理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖，如圖1所示。優(yōu)化后的Q-MS/MS條件見1.3.4節(jié)。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中CML（A）和CEL（B）的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of CML (A) and CEL in a mixed standard solution (B)

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)物以外的其他內(nèi)源性物質(zhì)與目標(biāo)物共洗脫出的樣品基質(zhì)對目標(biāo)物的離子化過程產(chǎn)生影響，造成離子化增強(qiáng)或抑制，從而影響檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[30]。熱加工食品樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，雖然UPLC-QqQ-MS/MS的抗干擾能力較強(qiáng)，但基質(zhì)效應(yīng)仍然存在，因此，需要對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，本研究選取曲奇、嬰兒肉松和薯條分別為烘焙類食品、嬰兒食品和煎炸食品的代表，將CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈和3 種食品基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.250～500 ng/mL），以相同物質(zhì)在食品基質(zhì)溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的百分比值評價基質(zhì)效應(yīng)情況，結(jié)果如表2所示?；|(zhì)效應(yīng)大于100%時，表明基質(zhì)使目標(biāo)物離子化增強(qiáng)；基質(zhì)效應(yīng)小于100%時，表明基質(zhì)使目標(biāo)物離子化減弱。結(jié)果表明，CML和CEL在不同食品基質(zhì)中均存在明顯的離子抑制現(xiàn)象，且同一物質(zhì)在不同食品中基質(zhì)效應(yīng)差異較小。由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，本方法在定量時采用空白基質(zhì)配標(biāo)，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 CML和CEL在不同食品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Metrix effects of different foods for CML and CEL determination

2.3.2 方法檢出限、定量限和線性范圍結(jié)果

配制不同質(zhì)量濃度（0.250～500 ng/mL）的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL），定量離子對的信號響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白基質(zhì)樣品中添加CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以信噪比RSN=3和RSN=10對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定方法的檢出限和定量限，結(jié)果如表3所示。CML和CEL的檢出限和定量限均分別低于朱玉潔[31]報道的UPLC-MS/MS方法（15.0 ng/g和45.0 ng/g）和Lin Qin等[32]報道的UPLC-Q-TOF/MS法（100 ng/g和300 ng/g），CML和CEL在0.25～500 ng/mL范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999）。

表3 CML和CEL的線性方程、相關(guān)系數(shù)R2、方法檢出限、定量限與線性范圍Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of CML and CEL

2.3.3 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果

為了評估該方法的準(zhǔn)確性，以油條為熱加工食品中的代表，用作基質(zhì)樣品，分別添加3 個水平（低、中、高）CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)溶液，以基質(zhì)樣品為基準(zhǔn)計算回收率。根據(jù)油條樣品中CML和CEL含量（10.64 μg/g和2.17 μg/g，干基），加標(biāo)量（以干基計）分別選取為CML：5、10、20 μg/g，CEL：1、2、4 μg/g。對加標(biāo)樣品平行測定6 次，連續(xù)測量3 d，得到儀器日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果如表4所示。此方法測定CML和CEL的回收率分別為96%～103%和94%～107%，日內(nèi)精密度分別為1.48%～2.02%和1.23%～1.66%，日間精密度分別為1.52%～2.43%和1.41%～1.84%。數(shù)據(jù)表明此方法用于定量分析典型AGEs具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，能夠較可靠地測定油條樣品中CML和CEL含量。

表4 CML和CEL的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations of CML and CEL in spiked samples (n= 6)

2.4 市售熱加工食品樣品分析評價

采集市場上的13 種烘焙類食品、嬰兒食品和油炸類食品樣品經(jīng)過前處理后，用已建立的UPLC-QqQMS/MS法進(jìn)行含量測定，如表5所示。從測定結(jié)果看，除嬰兒米餅（26.49 μg/g）外，嬰兒肉松和嬰兒餅干中CML含量（232.90 μg/g和155.46 μg/g）顯著高于烘焙食品（15.33～68.67 μg/g）和油炸食品（6.97～19.73 μg/g）（P＜0.05）。烘焙類食品包括餅干、曲奇、面包等的CML平均含量（36.36 μg/g）高于油炸類食品（12.78 μg/g）包括方便面、雞米花、薯條、油條等，這可能與烘焙溫度（＞200 ℃）高于煎炸溫度（～180 ℃）有關(guān)。嬰兒肉松中CEL含量（108.90 μg/g）明顯高于其他食品，是其他食品的5.82～45.56 倍。另外，同一種食品中CEL含量低于CML含量，這與Troise等[33]的結(jié)果一致。嬰兒食品的安全性關(guān)系到嬰兒的健康發(fā)育和成長，是人們最關(guān)注的食品安全問題之一。因此，針對嬰兒食品尤其是嬰兒肉松中CML和CEL含量較高的現(xiàn)象，探討嬰兒食品體系中CML和CEL的生成規(guī)律和抑制策略是后續(xù)研究的重點工作之一。

表5 市售13 種烘焙食品、嬰兒食品和煎炸食品中CML和CEL含量Table 5 CML and CEL contents in baked foods, baby foods, and fried foods determined by the proposed method

3 結(jié) 論

本研究通過對不同熱加工食品脫脂、還原、蛋白沉淀、酸水解和固相萃取等前處理條件以及色譜-質(zhì)譜分析條件的選擇和優(yōu)化，基于基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，建立UPLC-QqQ-MS/MS對熱加工食品中CML和CEL的同步檢測方法。該方法可操作性強(qiáng)，分析時間短，檢測成本低，基質(zhì)干擾小，檢出限低，回收率高，且具有良好的分離效果，可適用于不同熱加工食品樣品中CML和CEL的測定分析。