通過式SPE-UPLC-MS/MS測定植物油中的9 種酚類抗氧化劑

張艷俠，趙慧男，孫珊珊，徐向軍，鄭文靜，薛 霞，王明棟，劉艷明,*，祝建華,*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.中國石化天然氣分公司榆濟(jì)管道公司，山東 濟(jì)南 250101）

富含不飽和雙鍵的植物油易發(fā)生氧化變質(zhì)，為防止植物油酸敗，產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)，添加抗氧化劑防止或減慢油脂氧化作用，達(dá)到油脂原有的性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[1-2]。沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、2,4,5-三羥基苯丁酮（2,4,5-trihydroxybutyrophenone，THBP）、叔丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、去甲二氫愈創(chuàng)木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）、叔丁基對羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（Ionox-100）、沒食子酸辛酯（octyl gallate，OG）、2,6-二叔丁基對甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）及沒食子酸十二酯（dodecyl gallate，DG）等常用人工合成抗氧化劑因抗氧化效果好、價(jià)格低廉被廣泛應(yīng)用于植物油的防腐敗變質(zhì)，存在過量或違規(guī)使用的食品安全問題。毒理學(xué)研究表明，抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，如TBHQ能導(dǎo)致DNA損傷[3-4]。許多國家對該類抗氧化劑的使用及限量作了明確規(guī)定，日本及歐盟等國家禁止任何食品中添加TBHQ等抗氧化劑。我國的GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對部分抗氧化劑的最大使用限量做出了嚴(yán)格規(guī)定[5]。食品中人工抗氧化劑的控制成為食品安全問題的焦點(diǎn)。

食品中抗氧化劑常用的檢測方法有薄層色譜法、比色法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、電化學(xué)法[8]、氣相色譜法[9-11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]、高相液相色譜法[14-17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]。其中，薄層色譜法和比色法在定性、定量方面存在不準(zhǔn)確問題。氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對前處理要求高，方法相對復(fù)雜且抗干擾能力差。高效液相色譜法存在靈敏度差，定性不足等問題。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高靈敏度、高選擇性及定量定性準(zhǔn)確等特性，已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)獸藥殘留及添加劑的檢測中[20-21]。植物油的化學(xué)成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，常用的前處理方法有液液萃取法[22-23]、固相萃取柱法[24]、凝膠色譜凈化技術(shù)[25-26]、基質(zhì)固相分散法等[27-28]，這些方法存在前處理過程復(fù)雜、耗時，需要大量有毒有機(jī)溶劑，回收率低及不能兼顧多種抗氧化劑等問題。Oasis?PRiME HLB為通過型固相萃取柱，其特點(diǎn)是出色的除磷脂、蛋白及油脂等雜質(zhì)的作用，已有報(bào)道將其用于肉及肉制品、水產(chǎn)品、禽副產(chǎn)品等基質(zhì)中獸藥殘留的檢測[29-30]?，F(xiàn)行GB 5009.32—2016《食品中9 種抗氧化劑的測定》中第二法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，方法只包括PG、THBP、NDGA、OG及DG共5 種抗氧化劑，9 種抗氧化劑只能用高效液相色譜法檢測，極大限制了標(biāo)準(zhǔn)方法的使用[31]。將通過式固相萃取與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合，分析植物油中酚類抗氧化劑的研究尚鮮見報(bào)道。

本研究對植物油樣品經(jīng)酸化乙腈提取，通過式Oasis PRiME HLB凈化，超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立同時檢測植物油中9 種酚類抗氧化劑的快速檢測方法。采用的通過式Oasis PRiME HLB固相萃取柱無需活化和洗脫步驟，操作簡單、效率高，可以有效去除磷脂、脂肪和蛋白等干擾，降低基體效應(yīng)，提高回收率。該方法簡便快捷、靈敏度高、通量性好、檢測效率高，特別適合植物油中酚類抗氧化劑的定性、定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用油樣品均為市售。

THBP、TBHQ、NDGA、BHA、Ionox-100、OG、BHT及DG標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京曼哈格生物科技有限公司；PG（純度≥95%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；L-抗壞血酸棕櫚酸酯（L-ascorbgyl palmitate，AP）（純度＞97%） 美國TCI公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純） 德國默克公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；超純水為Milli-Q超純水機(jī)制備；氮?dú)猓ǎ?9.999%） 美國Millipore公司；標(biāo)準(zhǔn)品均于4 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTMUPLC I-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源和MasslynxTM色譜工作站）、HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters公司；3-18K高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；SB-800DTD型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司；MS3渦旋混合器 德國IKA公司；N-EVAP-45位氮吹儀 美國Organomation公司；SQP-電子天平 美國塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；Oasis?PRiME HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）、0.22 μm有機(jī)微孔濾膜 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）各抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶于10 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃避光保存。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇（含50 μg/mL AP）稀釋到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度得到抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，冷凍避光保存。

1.3.2 樣品前處理

提?。悍Q取均勻油樣品1 g（精確至0.000 1 g）于50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入10 mL含50 μg/mL AP的0.5%甲酸-乙腈溶液，渦旋5 min，超聲10 min，8 000 r/min離心5 min，將上層提取液移出，殘留油樣再加入8 mL含50 μg/mL AP 的0.5%甲酸-乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并2 次提取液。加入10 mL乙腈飽和正己烷，渦旋除脂后棄去正己烷層，取乙腈層定容至20 mL，待凈化。

凈化：準(zhǔn)確取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加3 mL乙腈進(jìn)一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40 ℃氮吹濃縮至近干，用1 mL甲醇復(fù)溶后，加1 mL水稀釋，渦旋混勻離心，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

取空白基質(zhì)樣品，按1.3.2節(jié)前處理步驟制備空白基質(zhì)溶液。分別用空白基質(zhì)溶液和定容溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到同質(zhì)量濃度水平的測定液。通過分別測定樣品空白基質(zhì)溶液與純?nèi)軇┲刑砑油侥繕?biāo)成分的響應(yīng)值，計(jì)算二者的相對比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，按下式計(jì)算：

基質(zhì)效應(yīng)為負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)為正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，0為無基質(zhì)效應(yīng)，絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。

1.3.4 色譜條件

HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）和水（B）；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～30% A，90%～70% B；3.0～5.0 min，30% A，70% B；5.0～10.0 min，30%～95% A，70%～5% B；10.0～12.0 min，95% A，5% B；12.0～12.1 min，95%～10% A，5%～90% B；12.1～14.0 min，10% A，90% B。流速：0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積2 μL。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓2.4 KV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度500 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速850 L/h；錐孔氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.12 mL/min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測；抗氧化劑的定性定量離子對、裂解電壓、駐留時間及碰撞能量見表1。

表1 9種抗氧化劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimal MS parameters for nine antioxidants

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的MasslynxTM色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，以及Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

9 種抗氧化劑均為含有不同酚羥基的化合物，在電噴霧離子源下易電離形成負(fù)離子。將1 μg/mL的9 種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動泵注入質(zhì)譜儀，通過一級質(zhì)譜掃描獲得相應(yīng)的母離子，優(yōu)化噴霧電壓、噴霧器溫度等質(zhì)譜參數(shù)獲得最優(yōu)離子源參數(shù)；隨后通過子離子掃描選擇信號強(qiáng)且穩(wěn)定的碎片離子，分別確定定性離子及定量離子，進(jìn)一步優(yōu)化裂解電壓、碰撞能量等參數(shù)，得到目標(biāo)化合物的MRM質(zhì)譜參數(shù)，具體見表1。

分析抗氧化劑結(jié)構(gòu)式及質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)，9 種酚類抗氧化劑均易失去H+形成[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，以THBP為例，見圖1。因結(jié)構(gòu)式中有多個酚羥基，使準(zhǔn)分子離子峰成簇狀（與同位素分布有所不同），這種簇狀碎片離子峰有助于對酚類抗氧化劑的輔助定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物丟1 個H+的[M-H]-碎片離子更穩(wěn)定，推測原因應(yīng)該是丟失1 個H+的帶電碎片若進(jìn)一步丟失離子或碎片在能量需求上會提高。二級碎裂方面，二級碎片均為丟掉其支鏈結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生信號較強(qiáng)的碎片離子、其他幾種抗氧化劑雖母體骨架不同，主要裂解規(guī)律均是丟失不同的支鏈結(jié)構(gòu)得到信號強(qiáng)且穩(wěn)定的碎片離子。此外BHT只有1 個酚羥基，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易電離，[M-H]-碎片響應(yīng)最高、最穩(wěn)定碎片，確定為定量離子，[M-OH]-為其定性離子?？傊?，通過對不同抗氧化劑裂解規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，化合物的質(zhì)譜裂解表現(xiàn)同其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，對于化合物準(zhǔn)確定性具有較好確證作用。

圖1 THBP二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 MS2 spectra of THBP

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

9 種抗氧化劑極性差異大，在色譜柱上保留行為有較大區(qū)別。常規(guī)C18色譜柱即對所有化合物保留，但不同色譜柱在分離度和峰形上有較大的差別。分別對BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C18（75 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進(jìn)行考察。在相同色譜條件下，BEH C18短柱對9 種抗氧化劑不能很好的分離，且峰拖尾嚴(yán)重，BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）雖然分離上達(dá)到了要求，對于含酚羥基較多的PG、THBP、OG及DG等化合物仍存在較嚴(yán)重的拖尾。HSS T3色譜柱具有消除酚類化合物或有機(jī)酸等化合物拖尾嚴(yán)重的作用。流動相方面，分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L醋酸銨溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液幾種流動相對目標(biāo)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇有更好的洗脫效果和峰形。加入醋酸銨后峰形拖尾嚴(yán)重，響應(yīng)降低，加入適當(dāng)甲酸在修飾峰形上效果較好，但加入酸后部分抗氧化劑響應(yīng)降低，特別是BHT響應(yīng)下降明顯，最終選擇乙腈-水為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，使目標(biāo)物與雜質(zhì)組分有效地分離，峰形良好，滿足要求，結(jié)果見圖2。

圖2 9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of nine antioxidant standard solutions

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取劑的優(yōu)化

食用油脂肪含量高，基質(zhì)復(fù)雜，且9 種酚類抗氧化劑性質(zhì)差異較大，如何高效率、低雜質(zhì)的提取是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵第一步。分別考察甲醇、乙腈、0.1%酸化乙腈、0.2%酸化乙腈、0.5%酸化乙腈、1%酸化乙腈作為提取劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純甲醇提取效率明顯高于乙腈，但對提取液進(jìn)行全掃描發(fā)現(xiàn)，甲醇提取的總離子響應(yīng)為乙腈的2 倍以上，且干擾峰更多，這應(yīng)該是質(zhì)子性溶劑甲醇對酚類抗氧化劑提取效果提升的同時對植物油中的雜質(zhì)共提取率也提高。

如何將提取效率與降低共萃物同時兼顧，實(shí)驗(yàn)考察在乙腈中加入不同濃度的甲酸，以期達(dá)到改變目標(biāo)物化學(xué)行為的目的。由圖3A可以看出，加入甲酸后，抗氧化劑提取效率有明顯的提高，應(yīng)該是對于弱酸性抗氧化劑，酸度的提高提高其分子狀態(tài)所占比，表現(xiàn)為在非質(zhì)子溶劑乙腈中溶解度提高。為較直觀比較幾種提取溶劑提取效率，設(shè)定乙腈提取效率為1，其他提取溶劑的提取效率與其比值為比較因子f，見圖3B。通過分析比較因子發(fā)現(xiàn)，隨著甲酸含量的提高，提取效率提升，不同酸度提取溶劑提取效率趨勢一致，其中DNGA變化最為明顯，結(jié)構(gòu)分析可能是含有4 個酚羥基受酸的影響大。當(dāng)酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%后，部分化合物回收率反而有所降低，可能是酸含量過高對質(zhì)譜響應(yīng)有一定的抑制作用。綜合考慮，選擇0.5%甲酸-乙腈為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對抗氧化劑提取效率的比較Fig.3 Recoveries of nine antioxidants with different extraction solvents

2.2.2 提取次數(shù)的優(yōu)化

以0.5%甲酸-乙腈為提取劑，考察提取次數(shù)對不同抗氧化劑提取效率的影響。分別對提取1、2、3 次進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)提取2 次回收率明顯高于1次，進(jìn)一步增加提取次數(shù)，回收率無明顯提高，因此以0.5%甲酸-乙腈提取2 次對植物油中抗氧化劑進(jìn)行處理。

2.2.3 穩(wěn)定劑的確定

抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液及前處理檢測過程中，部分抗氧化劑存在含量下降的現(xiàn)象，參考文獻(xiàn)[32]在抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液及提取溶液中加入AP改善標(biāo)準(zhǔn)溶液的存儲及前處理過程中抗氧化劑的不穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為50 μg/mL的AP即可保證9 種抗氧化劑含量穩(wěn)定。因此本研究在標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取溶劑中加入50 μg/mL的AP作為穩(wěn)定劑。

2.2.4 除脂方式的選擇

正己烷為一種常用除脂溶劑，并被用于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)。然而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈作為提取溶劑時，正己烷除脂后部分氧化劑會產(chǎn)生一定的損失。將正己烷萃取液氮吹，復(fù)溶后檢測，如圖4所示，折線為正己烷中溶解的抗氧化劑所占比例，發(fā)現(xiàn)BHT損失20%以上，其他抗氧化劑也有不同程度的損失。分析發(fā)現(xiàn)損失明顯的BHA、Ionox-100、BHT、DG幾種抗氧化劑，在結(jié)構(gòu)上因苯環(huán)上有不同數(shù)量的叔丁基或烷基長鏈而極性相對較低，更易溶于低極性的正己烷。當(dāng)提取溶劑中加入酸后，除脂步驟沒有引起回收率降低，部分回收率反而有所提高，推測原因應(yīng)該是酸度的提高使酚羥基以更高比例成分子狀態(tài)而參與自身的電荷傳遞，提高了極性，減少了目標(biāo)物的損失。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇酸性乙腈提取后，正己烷進(jìn)行除脂凈化。

圖4 不同除脂方式對抗氧化劑回收率的影響Fig.4 Effect of defatting solvents on recoveries of nine antioxidants

2.2.5 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)對直接提取、C18、HLB固相萃取柱、中性氧化鋁柱、氨基柱及PRiME HLB固相萃取柱幾種前處理凈化手段進(jìn)行比較。選擇空白花生油基質(zhì)分別在加標(biāo)回收、凈化液全掃描及基質(zhì)效應(yīng)等方面進(jìn)行比較。直接提取不經(jīng)凈化容易污染儀器，堵塞色譜柱，帶來嚴(yán)重基質(zhì)效應(yīng)，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。GB 5009.32—2016中所用的C18固相萃取柱對9 種抗氧化劑的保留不強(qiáng)，超過50%含量的目標(biāo)物在上樣過程中損失，在洗脫步驟僅有6.95%～53%含量的目標(biāo)物。同樣，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨基柱和中性氧化鋁柱對不同抗氧化劑保留上表現(xiàn)出了不同的選擇性，分別對BHA、Ionox-100、BHT和BHA、Ionox-100、BHT、TBHQ有一定的回收率，其他抗氧化劑幾乎無回收率，分析原因是2 種正相模式固相萃取柱對極性稍強(qiáng)抗氧化劑作用力太強(qiáng)，不容易洗脫下來。

圖5 不同凈化方式對抗氧化劑回收率的影響Fig.5 Effect of cleanup solvents on recoveries of nine antioxidants

由圖5可以看出，HLB固相萃取柱對所有抗氧化劑都有一定的保留，但回收率有一定的差別，TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100四種抗氧化劑回收率小于40%，PG、THBP、NDGA、BHA、OG、DG回收率在60%～80%，分析原因可能是HLB為親水親脂平衡共聚合填料，含有特定比例的親水基和疏水基，HLB的保留強(qiáng)弱與抗氧化劑的極性有關(guān)。PRiME HLB填料是在HLB基礎(chǔ)上開發(fā)的反相固相萃取凈化材料，無需活化和平衡步驟，凈化過程只吸附雜質(zhì)，目標(biāo)成分不保留。PRiME HLB對所有抗氧化劑回收率滿意，體現(xiàn)了其較好的通量性。此外，基質(zhì)效應(yīng)考察發(fā)現(xiàn)PRiME HLB凈化效果較C18和HLB好。對PRiME HLB凈化過程優(yōu)化，直接上樣收集后幾種抗氧化劑有小于10%的損失，需要進(jìn)一步的乙腈洗脫，因此本凈化過程合并兩次洗脫液后回收率和凈化效果均滿意。因此本研究選擇用酸化乙腈提取后PRiME HLB固相萃取柱凈化。

2.2.6 樣品定容液的選擇

分別對乙腈、甲醇、甲醇-水（80∶20，V/V）、甲醇-水（50∶50，V/V）、甲醇-水（20∶80，V/V）幾種定容溶劑進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的溶劑定容液，色譜峰形和質(zhì)譜信號有一定差異。質(zhì)譜響應(yīng)上，甲醇與乙腈相比目標(biāo)物響應(yīng)高，不同比例甲醇-水響應(yīng)變化不大。峰形方面，以色譜峰的不對稱因子對色譜峰進(jìn)行評價(jià)，不對稱因子為同高度處后半峰的寬度與10%峰高處前半峰的寬度之比，當(dāng)不對稱因子大于1時為拖尾峰，當(dāng)不對稱因子小于1時前延峰。從表2可以看出，以PG、THBP、TBHQ、NDGA幾種保留弱的抗氧化劑受溶劑效應(yīng)影響大，在高比例有機(jī)相中有明顯前延峰，降低有機(jī)相比例，前延峰得到較好改善。綜合考慮，選擇甲醇-水（50∶50，V/V）溶液作為樣品定容液。

表2 9種抗氧化劑不同定容溶液中色譜峰不對稱因子Table 2 Asymmetry factors (As) of different solvents to nine antioxidants

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限

將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白樣品溶液稀釋質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100、250、500、1 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（含50 μg/mL AP）。按質(zhì)量濃度由低到高依次測定，以各物質(zhì)定量離子對的峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.994。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，以信噪比為10得到目標(biāo)物的定量限，以信噪比為3得到目標(biāo)物的檢出限。結(jié)果見表3，9 種抗氧化劑檢出限在0.003～0.02 mg/kg之間，定量限在0.01～0.05 mg/kg之間，與現(xiàn)行方法比較具有較高靈敏度（表4）。

表3 9種抗氧化劑的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Calibration equations, correlation coefficients, linear ranges, and limits of detection and quantitation of nine antioxidants

表4 9種抗氧化劑在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中的定量限Table 4 LOQs specified in the national standard and reported in the literature for nine antioxidants mg/kg

2.4 回收率和精密度結(jié)果

表5 不同食用油中9種抗氧化劑加標(biāo)回收率及精密度（n=6）Table 5 Average recoveries and RSDs of nine antioxidants in spiked vegetable oil samples (n= 6)

分別在花生油、玉米油、大豆油中添加0.05、0.5、5.0 mg/kg三個水平的9 種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)測定6 次，按照1.3.2節(jié)前處理方法進(jìn)行提取凈化，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，結(jié)果如表5所示。加標(biāo)回收率在82.2%～115.2%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于9.3%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

圖6 植物油中9 種抗氧化劑基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)圖Fig.6 Matrix effects in HPLC-MS analysis of nine antioxidants in vegetable oil

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度，但基于其檢測原理，存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，通過正己烷除脂結(jié)合PRiME HLB對樣品提取液凈化，可以較好去除鹽、蛋白、脂肪及磷脂等干擾成分，降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)。按1.3.3節(jié)方法對花生油、玉米油、橄欖油、大豆油及調(diào)和油5 種植物油中9 種抗氧化劑的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)。如圖6所示，不同抗氧化劑在不同植物油中基質(zhì)效應(yīng)存在一定的差異，基質(zhì)效應(yīng)較小的為花生油和玉米油，基質(zhì)效應(yīng)稍嚴(yán)重的為橄欖油和調(diào)和油，分析原因可能與不同植物油中化學(xué)成分差異有關(guān)。不同抗氧化劑在不同植物油中受影響程度不同，色譜上出峰晚的抗氧化劑基質(zhì)效應(yīng)更明顯，應(yīng)該是植物油中主要干擾物為低極性化合物，隨著洗脫強(qiáng)度的提高，更多共流出物被洗脫下來。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配校正曲線定量，以減少基質(zhì)干擾對結(jié)果的影響。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法對市場上購買的玉米油、調(diào)和油、花生油等20 批次樣品進(jìn)行分析，有6 批次植物油檢出抗氧化劑，1 批次花生油中PG 、Ionox-100、DG含量分別為0.05、0.12、0.15 mg/kg；2 批次胡麻油中Ionox-100含量分別為3.15 mg/kg和27.6 mg/kg；1 批次牡丹籽油中BHT含量為36.0 mg/kg；2 批次紫蘇油中NDGA含量分別為6.03 mg/kg和14.8 mg/kg。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立采用新型通過式固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析植物油中9 種抗氧化劑的通量檢測方法。該方法通過保留雜質(zhì)的通過式凈化手段，結(jié)合高靈敏度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，實(shí)現(xiàn)不同植物油基質(zhì)中9 種抗氧化劑的同時檢測。該方法樣品前處理簡便快速，定性、定量準(zhǔn)確，可滿足植物油中9 種抗氧化劑的快速檢測，大幅提高了檢測效率，降低了檢測成本。