彭 粲，黃 鈞，黃家全，陳海風(fēng)，楊夢露，周榮清，3*

（1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川省郫縣豆瓣股份有限公司，四川 成都 611732；3.四川大學(xué) 國家制革清潔技術(shù)工程實驗室，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣醬是一種傳統(tǒng)調(diào)味料，在中國已有幾百年的歷史，在川渝地區(qū)被人們稱之為“川菜之魂”[1]。傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬僅使用四川、貴州等地的二荊條辣椒，而且整個發(fā)酵周期較長，導(dǎo)致產(chǎn)量較低，無法滿足火鍋、菜肴烹飪等產(chǎn)業(yè)的需求[2]。因此原料多樣、發(fā)酵周期較短的新型豆瓣醬（俗稱紅油豆瓣、火鍋豆瓣）應(yīng)運(yùn)而生，但不同品種辣椒原料的品質(zhì)差異較大[3-4]，導(dǎo)致豆瓣醬的品質(zhì)不穩(wěn)定。

目前對豆瓣醬的研究主要集中在工藝條件[5]、內(nèi)源性危害物[6]、菌種篩選[2]、特征風(fēng)味[7]等領(lǐng)域，而對不同品種辣椒發(fā)酵豆瓣醬的研究鮮有報道。近年來，品種適應(yīng)性研究已在其他體系中有所報道。葉子等[8]比較云南9個品種小米椒的品質(zhì)特性篩選出了最具適應(yīng)性的加工辣椒品種，有助于發(fā)酵小米椒品質(zhì)的改善。孫小靜等[9]研究貴州6種辣椒的各項指標(biāo)在發(fā)酵中的變化情況，選出了最適合辣椒醬發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)辣椒品種。李信等[10]比較不同大米釀造香醋的有機(jī)酸、氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)含量后發(fā)現(xiàn)糯米釀造的香醋風(fēng)味品質(zhì)更佳。

本研究以常用的三種辣椒品種（二荊條、美國紅和千斤紅）為原料，采用分光光度法、反相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和陽離子交換色譜法分別考察了相同的工藝條件下制備新型豆瓣醬發(fā)酵前后的色澤、辣度、揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)酸、辣椒堿、氨基酸和辣椒紅素等品質(zhì)指標(biāo)的變化?；诟咝б合嗌V、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和光譜等技術(shù)解析辣椒品種對豆瓣醬品質(zhì)的影響規(guī)律，為規(guī)范生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒醅：自然發(fā)酵3個月的二荊條、美國紅和千斤紅椒醅；蠶豆瓣：保溫發(fā)酵3個月的瓣醅；均由四川省郫縣豆瓣股份有限公司提供。

辣椒紅色素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：法國Extrasynthese公司；辣椒素、二氫辣椒素、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-蘋果酸、琥珀酸、乳酸、L-焦谷氨酸、辛酸甲酯（純度均＞95%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀（配備VF-WAX-MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Thermo Fisher Electron公司；1260高效液相色譜儀（配備UV/Vis 檢測器和反向C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）以及Alltech OA-1000有機(jī)酸柱（300 mm×7.8 mm））：美國Agilent 公司；A300氨基酸分析儀：德國membraPure GmbH公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；CM-5分光測色計：日本konicaminotia公司；C18固相萃取柱（solidphaseextraction，SPE）：成都思為科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆瓣醬的制備

辣椒采集后經(jīng)清洗、切割、拌鹽后，置于條池中自然發(fā)酵，前一個月每1 d翻醅一次，后兩個月每3 d翻醅一次，發(fā)酵3個月即可得到辣椒醅（混椒醅以1∶1比例混合）；蠶豆瓣經(jīng)98 ℃漂燙2～3 min，瀝干冷卻后，拌入小麥粉和米曲霉3.042，加入鹽水后，置于40～45 ℃保溫池發(fā)酵，類似于瓣子的翻醅工藝，發(fā)酵3個月后得到瓣醅。辣椒醅與瓣醅以4∶1混合均勻，將混合醅置于40 kg不銹鋼桶中進(jìn)行后發(fā)酵，裝入40 kg的不銹鋼桶，采用傳統(tǒng)日曬夜露的發(fā)酵工藝，前期（1個月）每3 d翻坯1次，后期隔15 d翻坯1次，發(fā)酵期間維持水分＞51%，發(fā)酵5個月得到成熟豆瓣醬[7，11]。樣品信息及編號如表1所示。

表1 樣品信息及編號Table 1 Information and number of samples

1.3.2 分析檢測

（1）理化指標(biāo)

氨基酸態(tài)氮（amino nitrogen，AN）、總酸（total acid，TA）：參照FENG J等[12]所述方法測定；水分含量：采用國標(biāo)GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》第一法中的直接干燥法測定；氯化物含量：采用硝酸銀滴定法[13]。

（2）非揮發(fā)性物質(zhì)

辣椒紅素：參照韓曉嵐等[14]方法，稍作修改；色度參考葉子等[8]方法檢測了豆瓣醬的明亮亮度L*值、紅綠度a*值和黃藍(lán)度b*值，并根據(jù)L*值、a*值和b*值計算色差ΔE*（ΔE*=

，其中“1”和“0”分別表示發(fā)酵前和發(fā)酵后的樣品。）和代表含色多少的飽和度C值（C=）；斯科維爾指數(shù)（scovill heat units，SHU）、天然辣椒堿、二氫辣椒堿及總辣椒堿含量：參照國標(biāo)GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測定及辣度表示方法》；有機(jī)酸含量：參照COCCHI M等[15]所述方法略修改；游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）含量：參考CUI R等[16]所述方法。

（3）揮發(fā)性物質(zhì)

參考ZHANG L等[17]所述方法，稍作修改。稱取2.000 g樣品置于15 mL萃取瓶中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)后，放入60 ℃水浴中預(yù)熱15 min，插入萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDM）留置50 min后，取出插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min后檢測。

GC條件：進(jìn)樣口溫度為270 ℃，升溫程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，然后6 ℃/min升至230 ℃保持10 min。載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.99%），流速為1 mL/min，不分流模式。

質(zhì)譜條件：離子源溫度300 ℃，傳輸線溫度250 ℃；電離方式為電子電離（electronicionization，EI）源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～400 u。

定性定量方法：通過將它們的質(zhì)譜與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）05文庫數(shù)據(jù)庫（Finnigan Co.USA）中的質(zhì)譜進(jìn)行比較來鑒定每種揮發(fā)性化合物。根據(jù)它們的相似性（＞800）來記錄化合物。通過GC總離子色譜圖上與內(nèi)標(biāo)的峰面積比計算揮發(fā)物的相對量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示（n=3）。本研究采用Origin 9.0為作圖軟件；使用SPSS 24.0軟件單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan's 功能進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）；使用SIMCA 14.1對多項指標(biāo)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要理化指標(biāo)變化

如表2所示，不同品種辣椒單獨(dú)、混合制備豆瓣醬的理化指標(biāo)均符合國標(biāo)GB/T 20560—2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品郫縣豆瓣》。辣椒品種對豆瓣醬的水分和氯化物含量影響不明顯，而顯著影響TA、AN的含量。美國紅豆瓣醬的TA和二荊條豆瓣醬的AN含量突出，且發(fā)酵后優(yōu)勢地位不變，分別為（2.41±0.00）g/100 g和（0.68±0.00）g/100 g。并且，發(fā)酵過程中因微生物代謝活動以及蛋白質(zhì)的分解導(dǎo)致豆瓣醬的TA、AN含量增加[18-19]。發(fā)酵后，二荊條與美國紅混椒豆瓣醬結(jié)合了各自單椒的優(yōu)點，使這兩個指標(biāo)在所有豆瓣醬中含量最高，分別是（2.78±0.01）g/100 g和（0.87±0.00）g/100 g。

表2 不同品種辣椒制備豆瓣醬發(fā)酵前后的主要理化指標(biāo)變化Table 2 Changes in main physical and chemical indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation

2.2 色度及辣度變化

發(fā)酵前后豆瓣醬的顏色指標(biāo)如圖1a～1c所示，發(fā)酵后所有豆瓣醬的L*值和C值均有不同程度的下降使色澤變暗淡，其中二荊條和美國紅的ΔE*值高于6.00，呈現(xiàn)肉眼可見的變化，且后者變化最明顯[8]?；旖返摩*均較低，發(fā)酵對色澤的影響相對較小。豆瓣中的紅色素主要為辣椒紅素[20]。如圖1d所示，發(fā)酵前單椒的含量差異顯著，二荊條的辣椒紅素含量最高，顏色最紅，發(fā)酵后弱化了該指標(biāo)的差異。千斤紅單椒和二荊條與美國紅混椒的含量增加可能是類胡蘿卜素間的生物合成與降解過程的競爭以及與色素之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)有關(guān)[21-23]。如圖1e～1h所示，單椒豆瓣醬間的辣度差異顯著，發(fā)酵后美國紅的總辣椒堿含量顯著降低了29.73%，而二荊條和千斤紅的含量僅略有變化，總辣椒素含量為二荊條（0.387±0.023）g/kg＞美國紅（0.261±0.022）g/kg＞千斤紅（0.176±0.01）g/kg?；旖分泻土瞬煌贩N的辣椒堿，使低辣度增加，高辣度減弱，風(fēng)味更柔和?；旖返目偫苯穳A含量為EM＞EQ＞MQ。

圖1 不同品種辣椒制備豆瓣醬發(fā)酵前后色度及辣度指標(biāo)的變化Fig.1 Changes in chromaticity and pungency degree indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation

2.3 有機(jī)酸和氨基酸

如圖2a所示，美國紅、千斤紅和二荊條初始豆瓣醬，分別以琥珀酸、檸檬酸、乳酸為優(yōu)勢酸。發(fā)酵后，有機(jī)酸含量增加，千斤紅含量最高為（50.12±0.17）g/kg（以干基計），與初始豆瓣醬明顯聚為不同兩簇，但相應(yīng)單椒豆瓣醬所屬的優(yōu)勢酸未改變。這可能與原料中有機(jī)酸的差異有關(guān)，也可能是原料差異導(dǎo)致部分微生物代謝差異有關(guān)[10]?；旖犯饔袡C(jī)酸含量介于相應(yīng)單椒之間，綜合了單椒的優(yōu)勢酸。如二荊條與美國紅混椒結(jié)合了二荊條的乳酸和美國紅的琥珀酸，乳酸使豆瓣醬風(fēng)味柔和，而琥珀酸增加了豆瓣醬的鮮味[20]?；旖范拱赆u中，二荊條與千斤紅混椒的有機(jī)酸含量最高。

圖2 不同品種辣椒制備豆瓣醬發(fā)酵前后有機(jī)酸（a）和氨基酸（b）變化Fig.2 Changes in organic acids (a) and amino acids (b) of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation

如圖2b所示，美國紅和千斤紅因脯氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸含量較高，而與二荊條聚在不同亞簇。發(fā)酵后，酵母的自溶和蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致FAA（除甲硫氨酸）增加[19]，其中美國紅增長至含量最高（37.31±0.45）g/kg，與其他單椒豆瓣醬顯著分開。天冬氨酸、天冬酰胺等多種FAA在美國紅豆瓣醬中呈現(xiàn)出較高優(yōu)勢，而脯氨酸和谷氨酸在千斤紅中較高。谷氨酸和天冬氨酸的風(fēng)味閾值較低（分別是0.3 mg/g和1.0 mg/g），對風(fēng)味貢獻(xiàn)大[19]，且是豆瓣醬的優(yōu)勢組分，比例為25.58%～28.54%，類似YANG M等[1]研究結(jié)果。

混椒中EM-1和EQ-1的FAA含量較高，因脯氨酸的差異分在不同亞簇。MQ-1的FAA含量較低可能是美國紅與千斤紅的混合影響了微生物群落改變了發(fā)酵規(guī)律[20]。

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

如圖3a所示，二荊條、美國紅和千斤紅的初始豆瓣醬揮發(fā)性成分的含量和組分因品種而異，分別是（10.21±1.64）mg/kg（85種）、（12.23±2.51）mg/kg（137種）和（4.20±0.68）mg/kg（142種）。發(fā)酵后，美國紅含量增加了16.50%，而二荊條和千斤紅分別降低了29.44%和13.71%，含量的差異顯著增加。單椒豆瓣醬由發(fā)酵前的54種共有組分增加到了69種，千斤紅的共有組分占總揮發(fā)性的比例由發(fā)酵前的66.48%增至82.72%，發(fā)酵驅(qū)動豆瓣醬的風(fēng)味輪廓更相似。如圖3b所示，根據(jù)揮發(fā)性組分的閾值[1，20]，有13種共有物質(zhì)香味活性值（odor activity value，OAV）＞1。其中愈創(chuàng)木酚、2-乙?；量┑?0種組分在美國紅中強(qiáng)度較高，而二荊條和千斤紅僅分別以芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯較為顯著。這些組分是傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品（如豆瓣醬[7，24]、醬油[18]和香醋[10]等）的特征香氣物質(zhì)。

圖3 不同品種辣椒制備豆瓣醬發(fā)酵前后揮發(fā)性組分含量變化（a）及共有組分（b）Fig.3 Changes in volatile components contents (a) and common constituents (b) of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation

二荊條、美國紅和千斤紅的特異性檢出物質(zhì)分別有25、18和34種，比例為2.7%、6.02%和9.8%。3-辛酮和戊酸乙酯提高了二荊條豆瓣醬的蘑菇香和果香[1]；糠醇在美國紅中檢出，可由美拉德反應(yīng)生成，但因閾值較高，風(fēng)味貢獻(xiàn)度較低[27]。丁酸乙酯賦予了千斤紅豆瓣醬水果香味[1]。

混椒豆瓣醬發(fā)酵前后的揮發(fā)性組分含量介于相應(yīng)單椒之間。EM-1的含量最高且共有組分與單椒中風(fēng)味較優(yōu)的M-1聚為同一亞簇，還富有2-甲基丁酸乙酯和β-紫羅蘭酮，因此風(fēng)味在混椒中最優(yōu)?；旖范拱赆u還兼有單椒的風(fēng)味物質(zhì)，EM-1、EQ-1和MQ-1分別有18種、24種、26種來自相應(yīng)單椒的特有組分。如EM-1既有來自二荊條的L-巖藻糖又有美國紅的3-辛醇。類似的，EQ-1既有戊酸乙酯又有丁酸乙酯，MQ-1既有β-紫羅蘭醇又有β-石竹烯。這些物質(zhì)使混椒豆瓣醬的香味更加多樣。

2.5 多元數(shù)據(jù)分析

為了綜合分析辣椒品種、復(fù)配辣椒以及發(fā)酵對豆瓣醬品質(zhì)的影響。聯(lián)合OAV＞1的香味物質(zhì)以及其他所有指標(biāo)建立模型，其中R2X、R2Y和Q2值分別表示PLS-DA模型在X軸和Y軸方向的累積解釋率和模型的預(yù)測能力，這些指標(biāo)越接近1表示模型擬合數(shù)據(jù)效果越好，R2X、R2Y和Q2值分別為0.988、0.966和0.823，表明模型可靠。如圖4所示，單椒豆瓣醬中，千斤紅與另兩者分為不同象限，差異較大。混椒豆瓣醬發(fā)酵前后均在對應(yīng)單椒豆瓣之間，豆瓣醬間的差距縮小，品質(zhì)差異縮小；其中MQ-1與千斤紅較為接近，EM-1與美國紅較為接近，品質(zhì)類似。風(fēng)味組分（如苯乙醛、2,3-丁二醇和多種游離氨基酸、有機(jī)酸）均在發(fā)酵后的美國紅單椒豆瓣醬以及二荊條與美國紅混椒豆瓣醬中明顯較高，表明其風(fēng)味突出。

圖4 不同品種辣椒制備豆瓣醬發(fā)酵前后品質(zhì)指標(biāo)的偏最小二乘法判別分析Fig.4 Partial least squares-discriminant analysis of quality indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation

25種代謝物的變量投影重要性分析值（variable importance for the projection，VIP）＞1,2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、壬醛、正癸醛、愈創(chuàng)木酚和辣椒堿等12個指標(biāo)集中于發(fā)酵前的豆瓣醬中，而4-乙基愈創(chuàng)木酚、2-乙酰基吡咯、β-紫羅蘭酮、乳酸、多種氨基酸、氨基酸態(tài)氮等13種物質(zhì)為發(fā)酵后豆瓣醬的特征指標(biāo)。呈香特征由花果香、草木香轉(zhuǎn)變?yōu)獒u香和紫羅蘭花香[7]；在呈味特征趨于圓潤及鮮甜味增加[19，24]；并且作為豆瓣醬分級指標(biāo)（GB/T 20560—2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品郫縣豆瓣》）的AN增加，均達(dá)到一級水平。

3 結(jié)論

從理化指標(biāo)、色澤、辣度、有機(jī)酸、氨基酸和風(fēng)味組分綜合分析了不同辣椒豆瓣醬發(fā)酵前后的品質(zhì)差異。結(jié)果表明，辣椒品種對豆瓣醬的品質(zhì)影響顯著。發(fā)酵后，豆瓣醬呈味的有機(jī)酸和氨基酸增加；色澤變暗、辣度降低、風(fēng)味相似度增加。多元分析結(jié)果表明，發(fā)酵減弱了品種帶入的品質(zhì)差異，驅(qū)使品質(zhì)趨于穩(wěn)定。美國紅單椒豆瓣醬的風(fēng)味較好，二荊條單椒豆瓣醬的辣度和色澤較優(yōu)。二者的混配綜合了單椒豆瓣醬的風(fēng)味特點，風(fēng)味多樣性增加并且AN和TA較高、色澤變化小、辣度柔和。因此，混椒縮小了豆瓣醬間的差異，該種混合方式更適合新型豆瓣醬的生產(chǎn)。