李冬芳 劉世雄 于春微 郝凌魁 陳 灰 高 民 胡紅蓮 劉大程*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

在羔羊養(yǎng)殖過(guò)程中，免疫力低下、斷奶應(yīng)激、長(zhǎng)途運(yùn)輸、羔羊腹瀉等是造成羔羊死淘率持高不下的主要因素，給肉羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，研究者們嘗試了多種措施來(lái)降低羔羊死淘率，其中酵母菌培養(yǎng)物類(lèi)產(chǎn)品顯示出了積極的功效，大量研究表明酵母菌培養(yǎng)物具有提高動(dòng)物機(jī)體免疫力和抗氧化能力、調(diào)節(jié)炎癥因子等生物功效[1-2]。Yuan等[3]的研究證實(shí)，添加酵母培養(yǎng)物可以提高犢牛血清免疫球蛋白A(IgA)含量，增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫應(yīng)答能力。飼糧中補(bǔ)充酵母培養(yǎng)物和維生素E可減少奶山羊熱應(yīng)激期間血清丙二醛(MDA)的含量，增加血清總抗氧化能力(T-AOC)[4]。β-葡聚糖是酵母細(xì)胞壁的主要成分，可提高機(jī)體非特異性免疫機(jī)能、改善動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境、改善機(jī)體抗應(yīng)激能力。β-葡聚糖通過(guò)抗原提呈細(xì)胞(APC)的內(nèi)吞作用將多糖片段傳遞給細(xì)胞表面并與T細(xì)胞的抗原受體(TCR)相結(jié)合，以此調(diào)節(jié)其分泌的白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子的平衡[5]。趙璐宇等[6]研究表明，添加酵母β-葡聚糖顯著提高了圍產(chǎn)期奶牛血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性，降低了產(chǎn)前血清MDA含量，有效緩解了圍產(chǎn)期奶牛的氧化應(yīng)激。

但是，目前國(guó)內(nèi)對(duì)復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖的研究主要集中在豬和雞等單胃動(dòng)物上，有關(guān)復(fù)合菌培養(yǎng)物對(duì)反芻動(dòng)物影響的報(bào)道較少，而且近期本課題組在動(dòng)物試驗(yàn)上的結(jié)果表明，復(fù)合菌培養(yǎng)物在抗應(yīng)激方面具有明顯的功效，特別是使羔羊腹瀉率明顯減少，并且增加了血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、IL-6的含量，提高了羔羊的免疫功能[7]。因此，本試驗(yàn)擬在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊抗氧化能力和炎癥因子含量的影響，旨在為復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖在肉羊養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合菌培養(yǎng)物的制備

根據(jù)本課題組前期研究成果[7]，復(fù)合菌培養(yǎng)物由麩皮、玉米渣、米糠、棉籽粕、玉米胚芽粕、白玉米皮等組成，將2株釀酒酵母菌、1株枯草芽孢桿菌和1株乳酸菌按2∶2∶1∶1比例混合，以15%接種量接入發(fā)酵料中，加水使含水量最終為45%，之后發(fā)酵48 h制成復(fù)合菌培養(yǎng)物，其營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)為：活性酵母菌數(shù)≥5×108CFU/g、β-葡聚糖含量≥0.55 mg/g、甘露聚糖含量≥0.34 mg/g、有機(jī)酸含量≥1.48 mg/g和多肽含量≥1.36 mg/g；干物質(zhì)(DM)含量為60.00%、粗蛋白質(zhì)含量(CP)為17.98%、中性洗滌纖維(NDF)含量為48.53%、酸性洗纖維(ADF)含量為24.73%、鈣(Ca)含量為0.14%、磷(P)含量為0.53%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

本試驗(yàn)于2019年5—8月在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗肉羊養(yǎng)殖園區(qū)進(jìn)行。選擇體重相近、50日齡的斷奶健康公羔羊30只，隨機(jī)分為3個(gè)組，包括2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)2只羔羊。各組的試驗(yàn)羊飼喂于同一圈中。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，為全混合日糧(TMR)；復(fù)合菌培養(yǎng)物組在TMR(干物質(zhì)基礎(chǔ))中添加復(fù)合菌培養(yǎng)物，前期每千克飼糧添加量為50 g，中期與后期每千克飼糧添加量為70 g；β-葡聚糖組在TMR(干物質(zhì)基礎(chǔ))中添加β-葡聚糖，每千克飼糧添加量為75 mg(純度≥85%)?；A(chǔ)飼糧參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平與課題組前期試驗(yàn)[8]相同。

試驗(yàn)前每組羔羊統(tǒng)一打上耳號(hào)，分圏飼養(yǎng)，進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)和防疫，定期進(jìn)行消毒。試驗(yàn)期共97 d，其中預(yù)試期7 d，正試期90 d，每天自由采食，飲水。

1.3 血液樣本采集

分別在試驗(yàn)期第1、30、60、90天晨飼前，對(duì)每只羊進(jìn)行頸靜脈采血，使用分離膠真空采血管采集5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝保存于-80 ℃冰箱中，用于抗氧化指標(biāo)和炎癥因子含量的檢測(cè)。

1.4 血清抗氧化指標(biāo)及炎癥因子含量的測(cè)定

血清超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定；血清GSH-Px活性采用比色法測(cè)定；血清T-AOC采用Fe3+還原法測(cè)定；血清MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；血清過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨法測(cè)定。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定血清促炎因子白細(xì)胞介素-lβ(IL-1β)、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和TNF-α及抑炎因子IL-4、IL-10的含量。

以上指標(biāo)測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定儀器為SynergyTM多功能酶標(biāo)儀，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理和計(jì)算，用SAS 9.0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示，P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表1可知，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與2個(gè)試驗(yàn)組的肉羊血清SOD、GSH-Px、CAT活性呈增加趨勢(shì)，從整個(gè)試驗(yàn)期的平均值來(lái)看，復(fù)合菌培養(yǎng)物組血清SOD、CAT、GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而β-葡聚糖組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。在第90天時(shí)，β-葡聚糖組的血清MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異(P>0.05)。3組血清T-AOC在第60天時(shí)達(dá)到最高，之后又下降，復(fù)合菌培養(yǎng)物組和β-葡聚糖組血清T-AOC比對(duì)照組分別顯著提高13.02%、24.19%(P<0.05)。

表1 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊血清炎癥因子含量的影響

由表2可知，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，3組羔羊血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量呈上升趨勢(shì)，第1天時(shí)，3組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；第30天、第90天時(shí)，與對(duì)照組相比，復(fù)合菌培養(yǎng)物組血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及β-葡聚糖組血清中TNF-α、IL-8、IL-6含量均顯著提高(P<0.05)；第60天時(shí)，復(fù)合菌培養(yǎng)物組與β-葡聚糖組血清IL-6含量比對(duì)照組分別顯著提高了9.75%、5.80%(P<0.05)，復(fù)合菌培養(yǎng)物組血清TNF-α含量比對(duì)照組及β-葡聚糖組分別顯著提高了29.44%、18.81%(P<0.05)。隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)組羔羊血清中IL-4、IL-10含量呈下降趨勢(shì)，第1天、第30天時(shí)，3組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；第60天、第90天時(shí)，復(fù)合菌培養(yǎng)物組血清中IL-4、IL-10含量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

表2 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊血清炎癥因子含量的影響

3 討 論

3.1 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊抗氧化能力的影響

在肉羊飼養(yǎng)過(guò)程中由于受各種因素的影響，動(dòng)物體內(nèi)不斷地產(chǎn)生大量氧自由基，進(jìn)一步誘導(dǎo)生物膜上的多不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，因此，MDA含量直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[9]。β-葡聚糖具有特殊的β-1，3鍵，這類(lèi)結(jié)構(gòu)具有供氧和供電子的能力，從而有效清除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)機(jī)體免遭脂質(zhì)過(guò)氧化物的損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加益生菌酵母β-葡聚糖能夠顯著降低血液中MDA含量，從而增強(qiáng)斷奶仔豬的血液抗氧化能力[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，復(fù)合菌培養(yǎng)物組及β-葡聚糖組血清MDA含量均顯著下降。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)都存在著清除自由基的酶促系統(tǒng)，如GSH-Px可保護(hù)機(jī)體組織的大分子成分，使其免受氧自由基侵襲，SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷[12]。本試驗(yàn)表明，飼喂復(fù)合菌培養(yǎng)物后肉羊血清GSH-Px、SOD、CAT活性均得到顯著提高，復(fù)合菌培養(yǎng)物發(fā)揮抗氧化作用可能與其富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，包括多種維生素、微量元素、酶、肽和寡糖(β-葡聚糖及甘露寡糖)[13]。袁文華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能夠顯著提高青年鴿肝臟中CAT、SOD、GSH-Px活性，這也進(jìn)一步證實(shí)了本試驗(yàn)的結(jié)果。機(jī)體免疫和抗氧化能力的增強(qiáng)也有利于生產(chǎn)性能的提高，課題組成員同批次試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)飼喂復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖后不僅使羔羊采食量增加，而且復(fù)合菌培養(yǎng)物組和β-葡聚糖組的平均體重分別較對(duì)照組提高了10.02%和5.05%，料重比分別較對(duì)照組降低了10.33%和4.21%[8]。

3.2 復(fù)合菌培養(yǎng)物及β-葡聚糖對(duì)肉羊血清炎癥因子含量的影響

血液是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，通過(guò)檢測(cè)血液免疫指標(biāo)可在一定程度上反映動(dòng)物的機(jī)體代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況及病理變化等狀況。依據(jù)“營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)組學(xué)”理論[15]，復(fù)合菌培養(yǎng)物對(duì)動(dòng)物的調(diào)控作用可能是由于其具有多種活性物質(zhì)協(xié)同作用，本課題組研制的復(fù)合菌培養(yǎng)物主要由酵母菌發(fā)酵而成，并含有甘露聚糖、β-葡聚糖、多肽及有機(jī)酸等多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)間相互協(xié)作并與益生菌協(xié)同激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)、改善動(dòng)物消化道的菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。

4 結(jié) 論

① 在TMR中添加復(fù)合菌培養(yǎng)物有助于肉羊血清中GSH-Px、SOD、CAT活性與T-AOC的提高及MDA含量的降低；在TMR中添加β-葡聚糖有助于肉羊血清中SOD活性的提高及MDA含量的降低。

② 在TMR中添加復(fù)合菌培養(yǎng)物提高了肉羊血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量；β-葡聚糖組肉羊血清中TNF-α、IL-6含量較對(duì)照組顯著提高。

③ 在TMR中添加復(fù)合菌培養(yǎng)物或β-葡聚糖均提高了肉羊的抗氧化能力與炎癥因子含量，并且添加復(fù)合菌培養(yǎng)物在抗氧化方面效果優(yōu)于添加β-葡聚糖。