中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中大豆異黃酮和大豆皂苷質(zhì)量濃度測(cè)定及抗高血壓功能

鐘 寶，羅興力

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.韓國(guó)全北國(guó)立大學(xué)，韓國(guó) 全州全北 54896）

0 引言

醬油（Soy sauce）是以大豆為原料制作的一種發(fā)酵食品，在中國(guó)已經(jīng)有近2 500年的歷史，在東亞的中國(guó)、韓國(guó)、日本作為一種調(diào)味料經(jīng)常食用[1]。李紅民等人[2]對(duì)醬油中大豆異黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果證明經(jīng)過(guò)發(fā)酵醬油中的大豆異黃酮含量明顯增加。田晶等人[3]優(yōu)化了醬油中皂苷的提取工藝，并測(cè)定了皂苷的含量。大豆及大豆發(fā)酵食品含有豐富的大豆異黃酮、皂苷等生物活性成分，這些成分對(duì)機(jī)體脂質(zhì)的積累和高血壓都有積極的調(diào)節(jié)作用。馮曉凡等人[4]研究表明，大豆異黃酮對(duì)肥胖大鼠的總膽固醇、甘油三脂和瘦素水平具有積極的調(diào)節(jié)作用。馬增春[5]研究表明，大豆異黃酮對(duì)高血壓造成的內(nèi)皮損傷具有改善功效。羅舒蕾等人[6]研究表明，大豆異黃酮和大豆皂苷對(duì)心血管疾病具有調(diào)節(jié)作用。句連云[7]進(jìn)行了大豆提取復(fù)合物對(duì)脂質(zhì)代謝研究，結(jié)果具有積極調(diào)節(jié)作用。醬油本身也對(duì)高血壓具有調(diào)節(jié)作用。Mun E G等人[8]的研究表明，韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油可以顯著改善大鼠因高鹽飲食誘發(fā)的高血壓。醬油在我國(guó)是日常生活中的重要調(diào)料，2015—2018年我國(guó)醬油產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，2019年產(chǎn)量開(kāi)始上升。因此，醬油中有效成分的測(cè)定對(duì)新型醬油的開(kāi)發(fā)和刺激醬油市場(chǎng)具有積極作用。目前，我國(guó)關(guān)于醬油的成分及功效研究報(bào)道相對(duì)較少，醬油中大豆異黃酮和大豆皂苷含量的測(cè)定，對(duì)醬油的功效研究將起到重要的作用。

2015—2019年中國(guó)醬油產(chǎn)量（數(shù)據(jù)來(lái)源：國(guó)家統(tǒng)計(jì)局）見(jiàn)圖1。

圖1 2015—2019年中國(guó)醬油產(chǎn)量

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

豆粕、小麥粉、米曲霉，均為市售；大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品、齊果墩酸標(biāo)準(zhǔn)品、香草醛乙醇、硫酸、甲醇，均為分析純。

Lamda 950 UV/Vis/NIR型紫外-可見(jiàn)-近紅外紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer產(chǎn)品；Ultimate3000型高效液相色譜儀，賽默飛世爾產(chǎn)品；KH-3200B型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司產(chǎn)品；索氏提取器；蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醬油制備

（1）工藝流程。豆粕→浸潤(rùn)→蒸制→晾涼→混合（小麥粉、米曲霉）→醬油曲→鹽水→發(fā)酵→淋油→過(guò)濾→殺菌→成品。

（2）操作要點(diǎn)。采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制備醬油。豆粕放入水中浸潤(rùn)5 h，于121℃條件下蒸制10 min，趁熱與生面粉拌和，比例為8∶2，涼至40℃，接種曲精（米曲霉）接種量為0.3%，在30℃條件下發(fā)酵2～3 d（每隔6 h翻拌1次，防止溫度過(guò)高），獲得醬油曲，取醬油曲加入體積2.5倍的鹽水，先后于45℃和30℃條件下分別發(fā)酵30 d，再經(jīng)淋油、過(guò)濾、殺菌獲得成品醬油，放入-20℃冰箱中保存待用。

1.2.2 醬油中大豆異黃酮測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)品制備。分別精密稱取大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入甲醇，配成0.2 mg/mL的儲(chǔ)備液，作為對(duì)照溶液待用。

（2）大豆異黃酮提取[9-10]。取醬油5 mL，加入5 mL甲醇，超聲處理30 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾，裝入HPLC分析瓶待用。

（3）色譜柱：YMC-Pack型，ODS，250 mm×4.6 mm×5μm；流動(dòng)相A：0.1%醋酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%醋酸乙腈溶液。采用線性梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～25 min，用5-80%B洗脫；25～35 min用80%B洗脫；35～45 min用80-5%B洗脫，體積流量0.8 mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.2.3 醬油中大豆皂苷測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取1.0 mg/mL的對(duì)照品齊果墩酸溶液20，40，60，80，100，120μL分別置于試管中揮干，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，搖勻；置于60℃恒溫水浴中加熱10 min，取出試管置冰水浴中冷卻15 min，以溶劑甲醇同法操作制備空白溶液，于波長(zhǎng)540 nm處讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品含量測(cè)定[11-12]。取適量樣品放入試管中揮桿，準(zhǔn)確稱取醬油試樣1.000 0 g，用濾紙包好放入索氏提取器中，先用乙醚脫脂2 h。取出濾紙筒晾干，再放回索氏提取器中用甲醇提取6 h。提取液減壓蒸干，蒸干物加水溶解，并在50 mL容量瓶中定容，準(zhǔn)確移取此溶液10 mL于分液漏斗中，用經(jīng)水飽和的正丁醇分4次提取，第1次用15 mL，第2，3，4次各用10 mL。有機(jī)相采用20 mL經(jīng)正丁醇飽和的水洗滌后，加熱蒸發(fā)至正丁醇徹底干燥。殘?jiān)蛹状既芙?，?0 mL容量瓶中定容，于波長(zhǎng)540 nm處讀取吸光度，計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮含量測(cè)定

2.2.1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

4種大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2，大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 4種大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)

圖3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間得到大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖。其中，大豆苷保留時(shí)間為10.183 min，相對(duì)峰面積為18.76%，相對(duì)峰高為25.51%，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.901 0 mg/mL；染料木苷的保留時(shí)間為11.605 min，相對(duì)峰面積為21.97%，相對(duì)峰高為20.97%，質(zhì)量濃度為0.772 1 mg/mL；大豆苷元的保留時(shí)間為14.593 min，相對(duì)峰面積為18.72%，相對(duì)峰高為18.55%，質(zhì)量濃度為0.617 5 mg/mL；染料木素的保留時(shí)間為16.677 min，相對(duì)峰面積為37.88%，相對(duì)峰高為33.35%，質(zhì)量濃度為0.848 5 mg/mL。

2.2.2 樣品中大豆異黃酮含量測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)待測(cè)醬油樣品進(jìn)行HPLC分析。

醬油中大豆異黃酮含量HPLC色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 醬油中大豆異黃酮含量HPLC色譜圖

根據(jù)相對(duì)峰面積和相對(duì)峰高，計(jì)算樣品中4種大豆異黃酮的含量。

醬油中大豆異黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 醬油中大豆異黃酮含量測(cè)定結(jié)果

醬油樣品中，大豆苷保留時(shí)間為10.143 min，相對(duì)峰面積為2.46%，相對(duì)峰高為1.68%，質(zhì)量濃度為0.035 4 mg/mL；染料木苷保留時(shí)間為11.623 min，相對(duì)峰面積為0.05%，相對(duì)峰高為0.05%，質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/mL；大豆苷元保留時(shí)間為14.605 min，相對(duì)峰面積為0.67%，相對(duì)峰高為0.58%，質(zhì)量濃度為0.006 6 mg/mL；染料木素保留時(shí)間為16.688 min，相對(duì)峰面積為0.09%，相對(duì)峰高為0.10%，質(zhì)量濃度為0.000 6 mg/mL。

2.3 大豆皂苷質(zhì)量濃度測(cè)定

以大豆皂苷的苷元類似物齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.000 693×10-2X+9.710 601×10-8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，樣品測(cè)定經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中大豆皂苷質(zhì)量濃度為8.942 4 mg/mL。

大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

圖5 大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論

醬油是以大豆為原料制作的發(fā)酵調(diào)味料，很大程度上保留了大豆的功效成分，同時(shí)經(jīng)過(guò)發(fā)酵工藝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，包括異黃酮、大豆皂苷等[13]。天然的大豆異黃酮通常與糖結(jié)合，會(huì)影響在人體腸道內(nèi)的吸收，使其利用率下降，而大豆發(fā)酵食品可以增加糖苷中異黃酮的含量，從而提高異黃酮的生物利用度[14]。研究表明，高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝釀造的醬油中，大豆苷質(zhì)量濃度為0.035 4 mg/mL，染料木苷質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/mL，大豆苷元質(zhì)量濃度為0.006 6 mg/mL，染料木素質(zhì)量濃度為0.000 6 mg/mL，大豆皂苷質(zhì)量濃度為8.942 4 mg/mL。該工藝釀制的醬油發(fā)酵時(shí)間較短，但樣品中大豆異黃酮和皂苷的質(zhì)量濃度較高，因此證明該醬油是具有一定功效的健康食品。高鹽飲食是誘發(fā)高血壓的重要因素之一，任潔等人[15]的研究表明，高鹽飲食喂養(yǎng)大鼠，會(huì)導(dǎo)致大鼠的血壓升高和造成腎臟損傷。醬油中雖然含有較高的鹽分，但是對(duì)血壓具有一定的調(diào)節(jié)作用，Mun E G等人[8]研究表明，韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油對(duì)高鹽飲食誘發(fā)的大鼠高血壓具有顯著的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)證明，中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油對(duì)高脂高鹽飲食誘發(fā)的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠高血壓具有積極的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)中，大鼠經(jīng)12周灌胃含鹽量為8%的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油，與高脂高鹽飲食（含鹽8%）攝入組相比，醬油灌胃組血清中的瘦素（高脂+高鹽飲食組含量3 145.9±293.5 pg/mL，高脂+醬油飲食組含量2 435±268.1 pg/mL；含鹽8%）；脂聯(lián)素（高脂+高鹽飲食組含量3 741.9±250.7 pg/mL，高脂+醬油飲食組含量5 323.3±181.8 pg/mL；含鹽8%）水平和腎素（高脂+高鹽飲食組含量21.0±0.77 pg/mL，高脂+醬油飲食組含量13.1±2.2 pg/mL；含鹽8%）水平都得到顯著改善。假設(shè)醬油中的大豆異黃酮和皂苷是調(diào)節(jié)脂質(zhì)和瘦素水平的主要功效成分，因此對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)醬油中的大豆異黃酮和大豆皂苷成分的分析，將為進(jìn)一步證明中國(guó)傳統(tǒng)醬油對(duì)高血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要參考。