袁 琳， 符金星， 劉雪菲丹， 高炳淼

(海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院/熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?571199)

0 引言

【研究意義】海葵(Aiptasiapallida)又名海菊花、海淀根，屬刺細(xì)胞動(dòng)物門珊瑚蟲綱六放珊瑚亞綱?？?，是原始的后生海洋動(dòng)物，全球已記錄?？? 100余種，分屬于50科約400屬[1]。中國的?？贩N約占世界的1/10，廣泛分布在溫?zé)釒Ш蜔釒ШＳ?，且明顯呈現(xiàn)“南海最多，黃海次之，東海最少”趨勢[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】《中華本草》和《中國藥用動(dòng)物志》均記載：?？哂惺諗抗虧?、燥濕殺蟲等功效，中醫(yī)用于治療脫肛、痔瘡和蟯蟲病等[3]?！肚鄭u中草藥手冊》記載：治蟯蟲病，將?？?塊塞入肛門，每晚1次，連用1周。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，?？嚯亩舅鼐哂袣⑾x、抗腫瘤、降壓、抗菌、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)抑制的作用[4-7]。?？饕ㄟ^刺細(xì)胞分泌毒液捕食魚、貝類、橈足類、甲殼類動(dòng)物及蠕蟲[8]。【研究切入點(diǎn)】傳統(tǒng)的?？嚯亩舅胤蛛x步驟費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、得率低，很難獲取足夠的量用于大規(guī)模生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[9-10]。近年來，廣泛應(yīng)用酶解法制備海洋生物活性肽，該法制備的海洋活性多肽既能補(bǔ)充機(jī)體營養(yǎng)成分，又具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤及抗凝血等活性[11-16]。目前，針對其抗蟲活性的研究鮮有報(bào)道[17]。【擬解決的關(guān)鍵問題】以套膜?？麨椴牧?，采用裂解液法提取?？偟鞍?；以酶解得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究不同蛋白酶對?？偟鞍酌附獾挠绊懀Y(jié)合正交試驗(yàn)篩選確定最優(yōu)酶解條件；同時(shí)，利用昆蟲注射法進(jìn)行多肽抗蟲活性分析，以期為拓展和開發(fā)海葵酶解多肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 套膜 海葵采集于儋州附近海域，用去離子水沖洗干凈，置于實(shí)驗(yàn)室-80℃冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 胃蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶，湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司；中性蛋白酶，上海一研生物科技有限公司；堿性蛋白酶，太原發(fā)凱化工有限公司；蛋白Marker，上海偉進(jìn)生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，廣州賽國生物科技有限公司；蛋白上樣緩沖液，天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 臺式低速大容量離心機(jī)，濟(jì)南博鑫生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，日立儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海啟前電子科技有限公司；數(shù)字型pH計(jì)，杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海鼎科科學(xué)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，蘇州索尼克超聲科技有限公司；酶標(biāo)儀，美國Bio Rad科技公司。

1.2 方法

1.2.1 海葵總蛋白的提取及含量測定

1) 總蛋白的提取。?？匀ルx子水洗凈后剪碎，超聲破碎至溶液渾濁，浸泡于異丙醇中去脂，每4 h更換1次異丙醇，連換3次，再用純水將異丙醇沖洗干凈[17]。置于通風(fēng)櫥中瀝干，分裝標(biāo)記，于-20℃保存?zhèn)溆?。取適當(dāng)樣品于小燒杯中，加入混合后的RIPA(放射免疫沉淀法)裂解液(強(qiáng))500 μL與PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)5 μL，靜置30 min后超聲破碎至溶液渾濁。4℃、10 000 r/min離心5 min，收集上清液得到粗品，真空冷凍干燥得干粉，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2) ?？偟鞍准捌涠嚯暮繙y定與SDS-PAGE分析?？偟鞍缀兔附舛嚯牡暮烤捎肂CA蛋白測定試劑盒測定。按說明書配方制膠，取凍干蛋白10 μL與2×Loading Buffer緩沖液10 μL混勻，置水浴鍋中95℃煮沸5 min，取Marker 10 μL上樣，電泳。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色觀察，用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄電泳結(jié)果。

1.2.2 最佳水解酶的篩選 根據(jù)蛋白酶種類試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，依次為胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。取去脂后的?？偟鞍? g加純水10 mL，分別加入相應(yīng)的蛋白酶，在各自最適條件下進(jìn)行酶解(表1)[18]。酶解完全后煮沸滅活15 min。濾液在12 000 r/min離心10 min，連續(xù)離心2次，收集上清液用0.45 μm濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH為7并將產(chǎn)物冷凍干燥，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝?jīng)SDS-PAGE電泳與BCA法同時(shí)分析酶解效果，根據(jù)酶解得率確定最佳水解蛋白酶。

表1 4種蛋白酶的最適酶解條件

酶解得率=多肽含量/總蛋白含量×100%

1.2.3 ?？偟鞍酌附鈼l件優(yōu)化 在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上綜合考慮各因素，選取pH、溫度、時(shí)間和最佳水解蛋白酶(堿性蛋白酶)添加量為獨(dú)立變量，酶解得率為因變量，采用4因素3水平L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表2)，優(yōu)化海葵總蛋白的最佳水解條件[19]。

表2 ?？偟鞍酌附鈼l件優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)的因素與水平

1.2.4 海葵酶解多肽的制備與殺蟲活性測定

1) 制備?？附舛嚯?。采用最佳酶解條件酶解?？偟鞍字苽浜？嚯?。酶解產(chǎn)物經(jīng)10 kDa超濾管離心，收集濾液獲得小于10 kDa的?？附舛嚯?，BCA蛋白測定試劑盒測定含量。

2) 殺蟲活性測定。按濃度0.50 μg/mg、0.75 μg/mg和1.00 μg/mg分別用0.7%鹽水將?？嚯娜芙庵苽涑珊？嚯娜芤簜溆?。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，其中，采用液體微量注射器分別注射5 μL前述濃度的?？嚯娜芤褐咙S粉蟲幼蟲的下腹部，劑量約為180 mg/頭;以注射等體積的0.7%鹽水(陰性對照)和不注射(空白)為對照，每組處理10只黃粉蟲，3次重復(fù)。注射后12 h內(nèi)觀察黃粉蟲的行為變化和死亡率，以評估?？附舛嚯牡臍⑾x效果[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?？偟鞍椎奶崛〖昂?/h3>

SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖1)表明，通過裂解液法提取到?？偟鞍?，其分子量主要分布在31.0～43.0 kDa，部分位于22.0 kDa及97.4 kDa，14.4 kDa及以下分布蛋白較少。因此，提取到的套膜?？哂胸S富的低分子量和高分子量蛋白質(zhì)，可以酶解獲得大量的多肽，便于發(fā)掘具有抗蟲活性的酶解多肽。BCA蛋白測定試劑盒測定結(jié)果表明，從20 g套膜?？刑崛『？偟鞍?60 mg，蛋白濃度為0.5 mg/mL。

注：M，低分子量蛋白Marker；1、2和3表示?？鞍讟悠窏l帶。

2.2 不同蛋白酶處理?？偟鞍椎拿附庑Ч?/h3>

采用4種不同蛋白酶酶解海葵總蛋白，其酶解得率為堿性蛋白酶(6.41%)>中性蛋白酶(5.23%)>胃蛋白酶(2.97%)>胰蛋白酶(1.53%)，其中，堿性蛋白酶的酶解得率最高，為最佳蛋白酶；其次是中性蛋白酶，胃蛋白酶和胰蛋白酶相對較低。從?？偟鞍酌附夂蟮亩嚯碾娪窘Y(jié)果(圖2)看出，堿性蛋白酶的酶解效果最好。結(jié)合酶解得率和電泳結(jié)果可以得出，堿性蛋白酶是?？偟鞍椎淖罴训鞍酌浮?/p>

注：M，低分子量蛋白Marker；1、2、3和4分別表示胃蛋白酶酶解樣品、胰蛋白酶酶解樣品、中性蛋白酶酶解樣品和堿性蛋白酶酶解樣品。

2.3 海葵總蛋白的酶解條件優(yōu)化

從表3看出，9個(gè)處理以A1B3C3D3的酶解得率最高，為9.145%；其次是A1B2C2D2、A2B1C2D3和A2B2C3D1，分別為8.395%、8.375%和8.325%。極差分析表明，各因素對?？偟鞍酌附獾寐实挠绊憺閜H>溫度>加酶量>時(shí)間。pH的影響最大，其中，pH 8>pH 9>pH10；溫度的影響其次，其中，55℃>60℃>50℃；加酶量的影響為4 000 U/g>1 000 U/g>2 000 U/g；時(shí)間的影響為2 h>6 h>4 h。綜上看出，堿性蛋白酶的最佳酶解條件組合為A1B3C3D3，即pH 8、加酶量4 000 U/g、溫度60℃、時(shí)間6 h。在此條件下，酶解產(chǎn)物得率為9.145%。

表3 正交試驗(yàn)?？偟鞍椎拿附獾寐?

2.4 ?？附舛嚯牡臍⑾x活性

從圖3看出，空白和陰性對照組中黃粉蟲的死亡率均為0，0.5 μg/mg(低劑量組)的黃粉蟲死亡率為10%，0.75 μg/mg(中劑量組)的黃粉蟲死亡率為50%，1.0 μg/mg(高劑量組)的黃粉蟲死亡率為90%。其中，0.5 μg/mg海葵酶解多肽處理的黃粉蟲死亡率與空白對照和陰性對照間均存在顯著差異，與0.75 μg/mg和1.0 μg/mg存在極顯著差異；0.75 μg/mg與1.0 μg/mg處理間也存在極顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存在劑量依賴性。說明，昆蟲注射法可用于評價(jià)?？附舛嚯牡臍⑾x活性。

注：**、***和****分別表示P<0.01、P<0.001和P<0.000 1。

3 討論

海葵是我國南海豐富的海洋生物資源，但目前尚未進(jìn)行深入開發(fā)和利用。主要原因在于：一方面是?？卸嚯亩舅睾可伲瑐鹘y(tǒng)分離和提取無法獲取足夠的量；另一方面是海葵多肽毒素毒性強(qiáng)烈，無法克服其存在的副作用。因此，?？囊?guī)模化和產(chǎn)業(yè)化研究受到嚴(yán)重制約，而尋找新的途徑開發(fā)?？Y源就顯得尤為重要。當(dāng)前，制備海洋多肽的常用方法：1) 傳統(tǒng)分離手段，直接從生物體或組織中分離提取多肽[21-22]；2) 針對已知多肽序列，采用化學(xué)固相合成法制備多肽[23-24]；3) 采用各種蛋白酶酶解大分子蛋白獲得多肽。對比以上3種制備海洋多肽的方法，其中酶解法制備海洋多肽具有產(chǎn)率高、安全性高及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[11，25-26]。

目前，國內(nèi)關(guān)于?？臍⑾x活性研究和酶解法制備具有生物活性肽的研究較少。劉少華等[4]從舟山黃海葵粗毒中篩選出7種多肽，其具有強(qiáng)殺蟲活性但對哺乳動(dòng)物低活性，即對脊尾白蝦及黃粉蟲幼蟲具有強(qiáng)且快速的麻痹、致死活性，對小鼠毒性雖較弱但仍會引起小鼠出現(xiàn)癱軟癥狀。吳宗澤等[17]采用堿性蛋白酶酶解綠側(cè)花?？鞍?，并利用超濾和色譜分離技術(shù)制備具有抗腫瘤活性的多肽。該研究采用裂解液法從套膜?？刑崛〉胶？偟鞍?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂解液法提取?？鞍撞僮骱唵?、經(jīng)SDS-PAGE電泳后條帶多且清晰分明，對后續(xù)試驗(yàn)無影響。蛋白酶篩選和優(yōu)化試驗(yàn)表明，海葵的最佳蛋白水解酶為堿性蛋白酶，且時(shí)間和pH等因素與吳宗澤等[17]研究一致。但堿性蛋白酶添加量和酶解溫度均較吳宗澤等[17]的高，原因可能是在一定范圍內(nèi)酶解得率與酶解溫度和加酶量呈劑量依賴關(guān)系。殺蟲活性試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)蛋白酶酶解后獲得的?？附舛嚯木哂袣⑾x活性，注射劑量為1.0 μg/mg時(shí)黃粉蟲的致死率達(dá)90%。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，采用裂解液法從套膜?？刑崛～@得的?？偟鞍追肿恿恐饕獮?1.0～43.0 kDa，部分位于22.0 kDa及97.4 kDa；20 g套膜?？商崛『？偟鞍?60 mg，蛋白濃度為0.5 mg/mL；海葵總蛋白的最佳水解酶為堿性蛋白酶；海葵總蛋白的最優(yōu)酶解條件為pH 8、堿性蛋白酶4 000 U/g、溫度60°C、酶解6 h，在此條件下酶解得率為9.145%；昆蟲注射?？附舛嚯?.0 μg/mg時(shí)死亡率達(dá)90%。因此，采用酶解法制備?？嚯暮唵慰尚?，不受?？疽毫康南拗?，同樣具有殺蟲活性且比?？疽簩Σ溉閯?dòng)物的安全性更高。

研究獲得適合?？偟鞍酌附獾淖罴训鞍酌敢约白顑?yōu)酶解條件，利用超濾技術(shù)得到?？附怆牟⒎治銎錃⑾x活性，可為深入開發(fā)?？Y源提供參考。