李 震，姚弘虞，王世豪，谷曉明，段小飛，孫偉鵬

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 鄭州 450052

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其病理機(jī)制涉及多個(gè)基因、多種信號通路的調(diào)控，治療多以手術(shù)、放化療和分子靶向治療為主[1-3]。MAPK信號通路中KRAS基因上游的表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑西妥昔單抗和帕尼單抗，現(xiàn)已成為結(jié)直腸癌治療的一線藥物[4-6]。對KRAS基因的進(jìn)一步研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，有很大一部分結(jié)直腸癌患者存在KRAS基因突變，并且這部分患者對EGFR拮抗劑治療無效。因此，從KRAS通路下游尋找新的治療靶點(diǎn)對于KRAS基因突變患者的治療意義重大。

WNT信號通路的異常表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡[9-10]。WNT 信號通路中關(guān)鍵的下游分子β-catenin增加會導(dǎo)致Cyclin D1的激活，通過影響細(xì)胞分裂周期G1期來抑制凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11-12]。已有文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道WNT信號通路的激活促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探索KRAS基因突變的結(jié)直腸癌與WNT信號通路之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1結(jié)直腸癌組織標(biāo)本收集2018年1月至2019年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科住院的206例患者的臨床資料及相應(yīng)的結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本，包括甲醛固定后的石蠟包埋組織和新鮮組織(置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)提取石蠟包埋組織DNA，檢測 KRAS基因第 2 號外顯子的12和13密碼子的突變位點(diǎn)。所有患者均無其他合并癥且無既往手術(shù)史、放化療史。本研究的開展經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過(審批號：2020-KY-454)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2結(jié)直腸癌組織中β-catenin、CyclinD1mRNA相對表達(dá)量的qRT-PCR檢測新鮮組織用Trizol法提取總RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。β-catenin上游引物序列： 5’-ATCATCGTGAGGGC TACTG-3’，下游引物序列：5’-CCATCCCTFCCTGTT TAGTT-3’ ；Cyclin D1上游引物序列： 5’-GCT GCGAAGTGGAAACCATC-3’，下游引物序列：5’-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物序列： 5’-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游引物序列：5’-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s,60 ℃退火 60 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.3細(xì)胞和主要材料人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(該細(xì)胞株KRAS基因的12密碼子發(fā)生突變[15])購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基(含雙抗)購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清和Lipofectamine 2000均購自賽默飛世爾科技有限公司，Trizol 試劑、Annexin-V/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司，特異性β-catenin siRNA和陰性對照siRNA(si-control)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，MTT購自美國Sigma公司，β-catenin 抗體、Cyclin D1抗體和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA(β-catenin siRNA組)或si-control(陰性對照組)，以不轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照組。β-catenin siRNA序列：正義鏈5’-CCCACTAATGTCCAGCGTT-3’；反義鏈5’-CGCTGGACATTAGTGGGTT-3’；si-control siRNA 序列：正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反義鏈 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.5 3組細(xì)胞中β-catenin、CyclinD1蛋白表達(dá)的Westernblot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解，提取總蛋白并利用BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照試劑盒操作要求進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，50 g/L脫脂牛奶液封閉1 h，分別加入β-catenin、Cyclin D1抗體(均按1∶1 000稀釋)和GAPDH抗體(按1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(按1∶10 000稀釋)，ECL顯色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光掃描，Image J軟件分析目的條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 3組細(xì)胞增殖的MTT法檢測將按1.4項(xiàng)分組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)孵育2 h，棄掉上清液，加入150 μL DMSO， 用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 3組細(xì)胞凋亡率的檢測細(xì)胞分組處理48 h后收集細(xì)胞，按照Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒說明操作。PBS清洗2次，加入100 μL 的 Loading Buffer混懸細(xì)胞后加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，避光孵育15 min，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較KRAS基因突變率在不同年齡段、性別、腫瘤部位、分化程度的結(jié)直腸癌組織的差異，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較KRAS基因野生型和突變型結(jié)直腸癌組織中β-catenin和 Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組細(xì)胞中β-catenin和 Cyclin D1蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖能力和凋亡率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1KRAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征相關(guān)性分析206例結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中，78例為KRAS基因突變型，128例為野生型，突變率為37.8%。KRAS基因突變率與患者性別、年齡、腫瘤部位和分化程度等均無關(guān)(表1)。

表1 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中KRAS基因突變的比較

2.2KRAS基因野生型和突變型結(jié)直腸癌組織中β-catenin和CyclinD1mRNA表達(dá)水平的比較見表2。

表2 KRAS基因野生型和突變型結(jié)直腸癌組織中β-catenin和 Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平的比較

2.3 3組細(xì)胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)的比較水平見表3。

表3 3組細(xì)胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 3組細(xì)胞增殖和凋亡的比較3組細(xì)胞A值的比較見表4。由表4可知，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在24、48、72及96 h的增殖能力均低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)?？瞻讓φ战M[(10.3±4.9)%]、陰性對照組[(9.9±4.6)%]和β-catenin siRNA組[(24.3±4.8)%]細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.939，P=0.016)，β-catenin siRNA組細(xì)胞凋亡率高于空白對照組(P<0.05)。

表4 3組細(xì)胞A值的比較

3 討論

結(jié)直腸癌是世界上病發(fā)率和致死率都很高的疾病之一，靶向藥物EGFR拮抗劑的使用讓結(jié)直腸癌患者獲益良多[16-18]。但是此藥物只對KRAS基因野生型的患者有效，對于KRAS基因突變的患者無效[19-21]。相關(guān)研究結(jié)果提示，KRAS 基因突變可能與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展有關(guān)[22]，且與腫瘤的多發(fā)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)[23]。對于KRAS基因突變型結(jié)直腸癌患者，尋找WNT信號通路中的分子靶點(diǎn)可為結(jié)直腸癌臨床靶向治療提供一個(gè)新的切入點(diǎn)。

WNT信號通路涉及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如肝癌、乳腺癌、胃癌等[22-27]。已有研究[28]報(bào)道在結(jié)直腸癌中KRAS/BRAF/MEK信號的激活刺激WNT/β-catenin通路，進(jìn)而促進(jìn)了腸道腫瘤的生長和侵襲，但是其具體機(jī)制尚不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌標(biāo)本中KRAS基因突變型占37.8%，且與結(jié)直腸癌臨床病理特征無明顯相關(guān)性。在KRAS基因突變型的結(jié)直腸癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)WNT信號通道相關(guān)蛋白β-catenin 和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平比在KRAS基因野生型的標(biāo)本中高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了進(jìn)一步了解KRAS基因突變與WNT信號通路的關(guān)系，在KRAS基因突變型的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中，利用基因干擾技術(shù)將WNT信號通道相關(guān)蛋白β-catenin基因干擾后使其表達(dá)降低，探索細(xì)胞增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)β-catenin基因干擾后細(xì)胞增殖能力下降，并促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KRAS基因突變型的結(jié)直腸癌可能通過抑制WNT信號通道相關(guān)蛋白來影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上，干擾WNT信號通道相關(guān)蛋白β-catenin基因有可能為KRAS基因突變型結(jié)直腸癌患者的臨床靶向治療提供一個(gè)研究思路，但具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究探討。