林 銳，孔祥東，李曉麗

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科 鄭州 450052

家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)主要特征表現(xiàn)為結(jié)直腸布滿大小的腺瘤，息肉多于青少年期出現(xiàn)，少數(shù)在幼兒時(shí)期開(kāi)始生長(zhǎng)，嬰兒時(shí)期未見(jiàn)生長(zhǎng)。息肉數(shù)量初起時(shí)不多，而后隨著年齡增長(zhǎng)而增多[1-3]。FAP全球發(fā)病率為1/10 000～1/7 000，是一種高度外顯的常染色體顯性家族性腫瘤綜合征，外顯率近100%，具有易復(fù)發(fā)和易癌變的特征，常惡變?yōu)榻Y(jié)直腸癌，與腺瘤性結(jié)腸息肉(adenomatouspolyposis coli,APC)基因突變有關(guān)[4]。APC基因的種系突變是導(dǎo)致FAP最常見(jiàn)的原因，APC基因定位于染色體5q21～5q22，含16個(gè)外顯子(其中第一外顯子不編碼)，編碼具有8個(gè)亞結(jié)構(gòu)的APC蛋白。APC蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡、黏附遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，通過(guò)負(fù)性調(diào)控WNT/細(xì)連環(huán)蛋白通路抑制結(jié)直腸腫瘤發(fā)生[5-6]。第15外顯子突變最為多見(jiàn)，可長(zhǎng)達(dá)6 574 bp，超過(guò)98%的突變是框移突變和無(wú)義突變，最終導(dǎo)致截短蛋白的產(chǎn)生。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)FAP家系進(jìn)行了突變篩查，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2017年4月至2019年11月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心并進(jìn)行基因檢測(cè)的4個(gè)FAP患者，男、女各2例，年齡29～35歲。所有患者進(jìn)行直腸指檢、體格檢查，血常規(guī)、糞便隱血試驗(yàn)、腫瘤標(biāo)志物CEA及CA19-9檢測(cè)，CT/MRI影像學(xué)檢查，直腸鏡、電子結(jié)腸鏡+病理活檢均符合FAP診斷標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)《遺傳學(xué)結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》[7]，F(xiàn)AP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸內(nèi)彌漫性息肉數(shù)量≥100個(gè)或者腺瘤性息肉數(shù)量<100個(gè)并伴有家族史或者先天性視網(wǎng)膜色素上皮肥厚。從該院遺傳與產(chǎn)前診斷中心DNA庫(kù)中隨機(jī)挑選200名健康對(duì)照，對(duì)照均排除腫瘤及全身疾病。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，本研究獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KS-2018-KY-36)。

1.2FAP基因突變檢測(cè)

1.2.1 基因組DNA提取 抽取患者外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，通過(guò)磁珠法提取試劑盒(美國(guó)Omega Bio-tek公司)和自動(dòng)化DNA提取設(shè)備(艾本德中國(guó)有限公司)提取樣本DNA，采用超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare公司)測(cè)定DNA的濃度和純度，DNA濃度均大于30 mg/L，A260 nm/280 nm達(dá)1.8～2.0。

1.2.2 高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 結(jié)直腸癌相關(guān)基因panel(包括MUTYH、BMPR1A、PTEN、POLE、BLM、GREM1、TP53、SMAD4、STK11、POLD1、EPCAM、MSH2、MSH6、CHEK2、MLH1、APC、PMS2、GALNT12)在Ion torrent PGM高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)靶向擴(kuò)增并進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，制備模板并富集純化，加入測(cè)序引物和聚合酶后，在芯片上樣，通過(guò)Ion PGM擴(kuò)二代測(cè)序(Sequencing 200 kit v2)試劑盒進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。通過(guò)Ion Torrent Suite 4.0.2軟件處理分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，用序列比對(duì)插件、coverage分析插件、varrentcaller插件進(jìn)行進(jìn)一步分析；在Ion reporter軟件上參考人類(lèi)基因組版本hg19(https://ionreporter.1ifetechnologies.com/ir/)進(jìn)行變異注釋。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 參考Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列，應(yīng)用Gene Tool軟件設(shè)計(jì)APC基因第15外顯子的引物，由上海生工生物有限公司合成(引物序列見(jiàn)表1)。純化PCR產(chǎn)物后采用ABI BigDye Terminator v3.1試劑盒測(cè)序，在ABI 3130XL 基因測(cè)序儀上進(jìn)行直接雙向測(cè)序，最后用Chromas軟件分析測(cè)序數(shù)據(jù)，尋找變異位點(diǎn)。

表1 APC基因外顯子引物序列

1.3突變命名及致病性判定通過(guò)dbSNP、1000G、ExAC和PubMed等公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢索，未在人類(lèi)基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)(human gene mutation database,HGMD)專(zhuān)業(yè)版記錄中記錄同時(shí)也未被公共數(shù)據(jù)庫(kù)和學(xué)術(shù)論文報(bào)道過(guò)的變異可視為新變異。新突變的命名參考國(guó)際基因突變命名體制(http://www.hgvs.org/mutnomen)的命名法命名；參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南，評(píng)判突變位點(diǎn)的致病性。

2 結(jié)果

2.1臨床分析4個(gè)FAP家系中4名先證者的家系圖譜見(jiàn)圖1,臨床資料見(jiàn)表2。

□：正常表型男性；○：正常表型女性；■：男性患者；●：女性患者；箭頭所指為先證者

表2 FAP家系先證者一般情況

2.2FAP基因突變檢測(cè)結(jié)果家系1：先證者攜帶APC基因c.4348C>T(p.Arg1450Ter)[8]雜合變異，該變異為無(wú)義變異(圖2A)，導(dǎo)致APC蛋白翻譯提前終止，使APC蛋白含量減少或功能缺陷，HGMD專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道其與FAP相關(guān)。結(jié)合先證者病史及家族腫瘤史，初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。

家系2：先證者攜帶APC基因c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)雜合變異(圖2B)，該變異在正常人群中的頻率為零，為低頻變異，未見(jiàn)相關(guān)致病性報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)突變，根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南，初步判定該變異為疑似致病變異。結(jié)合先證者病史及家族腫瘤史，初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。

家系3：先證者攜帶APC基因c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)[9]雜合變異(圖2C)，該變異為低頻變異，HGMD專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道其與FAP相關(guān)，根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南，初步判定該變異為疑似致病變異。家系分析顯示，先證者母親因腸癌去世無(wú)法追蹤突變來(lái)源，先證者妹妹同樣攜帶該變異，先證者父親該位點(diǎn)無(wú)突變。結(jié)合該家系的家族史，推測(cè)已故先證者母親為該突變導(dǎo)致的腸癌患者的可能性極大。

家系4：先證者攜帶APC基因c.3594_3595delAA(p.Lys1199Glufs*8)雜合變異(圖2D)，該變異為低頻變異，未見(jiàn)相關(guān)致病性報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)突變，根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南，該變異初步判定為疑似致病變異。家系分析顯示，先證者父親攜帶該變異，先證者母親該位點(diǎn)無(wú)突變，符合常染色體顯性遺傳方式及突變-表型共分離規(guī)律。

A～D:分別為家系1～4

3 討論

腺瘤病理檢查和內(nèi)鏡下結(jié)直腸息肉數(shù)目是目前臨床診斷FAP的主要依據(jù)，但某些消化道息肉疾病如Lynch綜合征、Peutz綜合征、MYH相關(guān)性息肉病、幼年性息肉綜合征、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌等與FAP難以區(qū)別，這使明確臨床診斷困難。因此，通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分子診斷可以輔助臨床及早準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷和治療。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)FAP家系進(jìn)行了全外顯子組檢測(cè)分析，具有耗時(shí)短、成本低、數(shù)據(jù)量足等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果均經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

有研究[9-10]報(bào)道西方人群中APC基因突變類(lèi)型與臨床表型相關(guān)，突變密集區(qū)位于密碼子第1 027～1 354位，其中第1 061和1 309位密碼子的5 bp缺失是突變熱點(diǎn)，該突變導(dǎo)致的病變出現(xiàn)時(shí)間早、表型嚴(yán)重。第9外顯子、密碼子1～157位和1 595～2 843位的突變與輕型FAP相關(guān)(息肉小于100枚)[11]。本研究中，4例患者APC基因突變均發(fā)生在第15外顯子，與已有報(bào)道相同。

本研究中，4個(gè)家系檢出的APC基因分別為c.4348C>T(p.Arg1450Ter)、c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)、c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)、c.3594_3595del(p.S1198fs)4個(gè)變異，均是位于第15外顯子的無(wú)義突變和框移突變，均可導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)編碼截短蛋白，截短蛋白的出現(xiàn)可造成β連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核增多進(jìn)而導(dǎo)致多種癌基因表達(dá)，其中c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)和c.3594_3595del(p.S1198fs)變異均為未報(bào)道過(guò)的變異。

本研究不僅拓展了FAP致病基因變異譜，而且為理解該病的分子病理機(jī)制提供了重要信息，對(duì)該病的準(zhǔn)確診斷、家系的遺傳咨詢具有指導(dǎo)意義。針對(duì)這樣的家系應(yīng)詳細(xì)詢問(wèn)家族史，當(dāng)家族成員中有相似表型時(shí)，及時(shí)進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查同時(shí)結(jié)合基因檢測(cè)，及早監(jiān)測(cè)攜帶突變而尚無(wú)臨床表型的家庭成員，以預(yù)防結(jié)直腸癌變。

隨著FAP臨床表型與APC基因相關(guān)性認(rèn)知的深入研究和進(jìn)展，臨床工作者可利用更先進(jìn)的遺傳篩查技術(shù)更早、更準(zhǔn)確地對(duì)患者進(jìn)行診斷和治療，基因檢測(cè)結(jié)果可與臨床診斷相輔相成。此外，無(wú)家族史的FAP群體篩查也應(yīng)受到重視，對(duì)于群體篩查，高通量測(cè)序也是一種適宜的技術(shù)。