不同部位冷卻牛肉成熟過程中水分變化研究

左惠心 溫 彬 朱立賢 羅 欣 牛樂寶 張一敏

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，泰安 271018)

0 引言

肉品保水性(Water-holding capacity，WHC)是指肌肉受到外力作用時(shí)保持其原有水分與添加水分的能力。牛肉的保水性作為一種重要的加工品質(zhì)，對牛肉產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生重要影響[1]。不同部位牛肉的品質(zhì)具有顯著差異，保水性不僅對牛肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性等產(chǎn)生重要的影響，而且具有經(jīng)濟(jì)意義[2-3]。明確不同部位冷卻牛肉在成熟過程中保水性的差異和變化規(guī)律，有助于采取相應(yīng)的措施控制牛肉汁液損失。

不同部位的牛肉在價(jià)格和食用品質(zhì)方面存在巨大差異[4]，不同部位牛肉的保水性也存在差異[5]。為了控制肉品汁液損失，減小因汁液損失而導(dǎo)致的企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，研究不同部位肌肉的保水性至關(guān)重要。目前，關(guān)于不同類型肌肉的食用品質(zhì)研究多集中在嫩度方面[6]，涉及不同部位保水性的差異及其原因的研究較少。文獻(xiàn)[7]研究表明，不同部位肌肉的食用品質(zhì)(肉色、嫩度、保水性和風(fēng)味等)具有一定的差異性，且宰后不同部位肌肉的成熟速率也不同。在肉品貯藏、加工和運(yùn)輸過程中，任何導(dǎo)致肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性破壞的因素都會引起肉品的保水性下降[8-9]。文獻(xiàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)，24、48、120 h的肌肉中，肌原纖維外空間存在差異，導(dǎo)致了肌肉中水分分布存在差異。但關(guān)于不同部位肌肉在成熟過程中的變化和產(chǎn)生差異的原因尚未進(jìn)行分析。

因此，本文以冷卻牛背最長肌、半膜肌和腰大肌作為研究對象，從貯藏?fù)p失、橫向弛豫特性和肌肉結(jié)構(gòu)等方面闡述3種部位冷卻牛肉在成熟過程中保水性的變化，分析產(chǎn)生差異的原因，以期為提高牛肉的保水性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用牛肉樣品采自山東省陽信縣某公司，挑選8頭質(zhì)量相近、18～24月齡的雜交公牛(魯西黃?！廖鏖T塔爾牛)，屠宰后胴體在排酸庫冷卻成熟24 h，取左半胴體的背最長肌(第12根胸肋到腰椎末尾)、半膜肌、腰大肌部位，將肉樣于4℃環(huán)境溫度下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將肉樣分割成2.54 cm厚度的牛排并進(jìn)行托盤包裝，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

蔗糖(分析純)、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(分析純)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蘇木素染液套裝，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB104-S型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；BD-145HDE型冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜(青島海爾特種電冰柜有限公司)；NMI20-015V-I型核磁共振成像儀(上海紐邁電子科技有限公司)；BX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；Nikon Eclipse E100型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1貯藏?fù)p失的測定

參照文獻(xiàn)[11]的方法，將各部位牛肉分割為2.54 cm厚度的牛排后，稱其質(zhì)量m1并記錄，托盤包裝后置于環(huán)境溫度為0 ～ 4℃的冷庫中避光成熟，分別在成熟2、3、5、7 d取出牛排，用濾紙吸干牛肉滲出的汁液，再次稱量記為m2。重復(fù)3次取平均值。貯藏?fù)p失率W計(jì)算公式為

1.3.2橫向弛豫特性的測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改。低場核磁共振(Low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)測定前將儀器預(yù)熱30 min以上，測試溫度為32℃。測定樣品前使用標(biāo)準(zhǔn)油樣采用自由感應(yīng)衰減(Free induction decay，F(xiàn)ID)序列(質(zhì)子共振頻率為21 MHz，等待時(shí)間為2 000 ms，接收機(jī)帶寬為100 kHz，開始采樣時(shí)間為0.05 ms，模擬增益為20，數(shù)字增益為3，累加次數(shù)為4)進(jìn)行校準(zhǔn)。肉樣延肌纖維方向分切為1 cm×1 cm×2 cm的肉條，稱量后輕輕放入直徑為12 mm的核磁試管底部，32℃水浴加熱至肉樣內(nèi)部恒溫，擦干管壁后進(jìn)行測定。樣品的測定采用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)序列，質(zhì)子共振頻率為21 MHz，等待時(shí)間為2 500 ms，接收機(jī)帶寬為250 kHz，測量回波間隔為0.6 ms，回波次數(shù)為10 000，累加次數(shù)為8。肉樣平行測定3份取平均值，數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

1.3.3核磁成像的測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改。肉樣的核磁成像測定前將儀器預(yù)熱30 min，測試溫度為32℃。在測試樣品前，使用標(biāo)準(zhǔn)油樣進(jìn)行校準(zhǔn)，并對樣品進(jìn)行定位預(yù)掃描后進(jìn)行正式成像。重復(fù)時(shí)間為500 ms，測量回波間隔為20 ms，重復(fù)次數(shù)為4，成像尺寸為50 mm× 50 mm，肉樣成像厚度為3 mm，同一樣品進(jìn)行2層成像，成像方式為橫斷面，圖像保存為fid文件格式進(jìn)行后續(xù)偽彩處理。

1.3.4肌節(jié)長度的測定

參照文獻(xiàn)[13-14]的方法并稍做修改。在成熟1、2、3、5、7 d取背最長肌、半膜肌和腰大肌的牛肉樣品2 g，置于50 mL燒杯中，加入4℃預(yù)冷的0.25 mol/L蔗糖溶液18 mL，低速勻漿(轉(zhuǎn)速約為6 000 r/min)1 min，然后取懸浮液制作載玻片，在Olympus BX41型光學(xué)顯微鏡下放大1 000倍觀察并拍照，每個樣品取5個平行樣(載玻片)，每個樣品拍攝25幅圖像，總共測量125次。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量肌節(jié)長度。125次測量結(jié)果的平均值即為該樣品的肌節(jié)長度。

1.3.5肌細(xì)胞顯微圖像及肌纖維直徑的測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改。在各成熟時(shí)間點(diǎn)沿肌纖維方向取肉樣，置于脂肪專用固定液固定24 h以上，對樣品修整后進(jìn)行梯度酒精脫水并進(jìn)行石蠟包埋和切片，依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min后用自來水清洗。之后用蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗。隨后將切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5 min。再將切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min后進(jìn)行中性樹膠封片。最后進(jìn)行顯微鏡鏡檢，對圖像進(jìn)行采集。數(shù)據(jù)分析時(shí)，使用Pannoramic Viewer將采集的圖像放大為原樣品的200倍，并使用Adobe Photoshop CC 除去肌纖維間的結(jié)締組織，通過Image-Pro Plus 6.0測量獲得肌纖維直徑。每份樣品取50個結(jié)果，取平均值記為該樣品的肌纖維直徑。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件以成熟時(shí)間、部位為固定因子，采用一般線性模型(General linear model，GLM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用多重比較選擇(Least significant difference，LSD)比較主效應(yīng)因素。采用Image-Pro Plus 6.0分析肌節(jié)長度和肌纖維直徑數(shù)據(jù)，低場核磁共振數(shù)據(jù)通過核磁共振成像儀自帶的反演軟件、采用聯(lián)合迭代重建技術(shù)(Simultaneous iterative reconstruction technique，SIRT)方法反演獲得，核磁成像偽彩圖通過紐邁核磁共振圖像處理軟件V1.0分析獲得。采用Orign 2018軟件對數(shù)據(jù)制圖。所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位牛肉成熟過程中貯藏?fù)p失變化

貯藏?fù)p失率表示牛肉在成熟過程中流失的汁液占總質(zhì)量的百分比，相同時(shí)間點(diǎn)貯藏?fù)p失率越小表明其保水性越好，是衡量牛肉保水性的重要指標(biāo)之一。從表1可以看出，成熟時(shí)間和部位對貯藏?fù)p失影響顯著(P<0.01)，成熟時(shí)間和部位的交互作用對貯藏?fù)p失影響不顯著(P>0.05)。隨著成熟的進(jìn)行，貯藏?fù)p失率平均值由1.09%顯著上升至2.34%(P<0.05)，說明3種部位牛肉隨成熟時(shí)間的延長，汁液流失顯著增多。腰大肌的貯藏?fù)p失率(1.36%)顯著低于背最長肌(1.86%)和半膜肌(2.09%)(P<0.05)，說明腰大肌的保水性高于其余兩組。貯藏?fù)p失率與成熟時(shí)間呈正相關(guān)(表1)，表明隨成熟時(shí)間延長，汁液流失更嚴(yán)重。文獻(xiàn)[15]也表明貯藏處理的時(shí)間越長，貯藏?fù)p失越高。文獻(xiàn)[16]同樣表明牛背最長肌無論在托盤、真空還是氣調(diào)包裝中進(jìn)行貯藏，其貯藏?fù)p失均持續(xù)上升。肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞而導(dǎo)致肌肉汁液滲漏可能是其主要原因[9]。

表1 不同部位牛肉成熟過程中貯藏?fù)p失變化

2.2 不同部位牛肉成熟過程中橫向弛豫特性變化

低場核磁共振通過測定肉品中氫原子核在磁場中的弛豫特性可以分析肉品中水分的分布和狀態(tài)[12]。圖1為牛肉成熟過程中橫向弛豫特性的變化，圖中出現(xiàn)了3種峰，峰Ⅰ、峰Ⅱ及峰Ⅲ分別代表結(jié)合水(0～10 ms)、不易流動水(10～100 ms)和自由水(100～1 000 ms)，這與文獻(xiàn)[17]的研究結(jié)果相一致。從圖中可以看出，隨著成熟時(shí)間的延長，3種部位牛肉的不易流動水(峰Ⅱ)的峰高呈現(xiàn)下降趨勢，但結(jié)合水與自由水的變化趨勢不明顯。因此為了更好地分析3種水分的變化，對各峰的峰面積及其比例進(jìn)行了顯著性分析(表2)，從而更好地分析水分隨成熟時(shí)間的變化。

表2 不同部位牛肉成熟過程中弛豫峰面積A2變化

2.2.1弛豫峰面積變化

由表2可知，隨著成熟時(shí)間的延長，3種部位牛肉的A2b由1 d的99.37顯著降低至7 d的79.83，背最長肌的A2b顯著高于半膜肌與腰大肌(P<0.05)，后者之間無顯著差異(P>0.05)。文獻(xiàn)[18]認(rèn)為，由于結(jié)合水占據(jù)總水分的比例不大，其整體的變化對肌肉保水性無太大影響。對于不易流動水峰面積A21，僅成熟時(shí)間對A21影響顯著(P<0.01)，部位對A21影響不顯著(P>0.05)，且成熟時(shí)間和部位的交互作用對A21影響不顯著(P>0.05)。結(jié)合圖1與表2可以看出，隨成熟時(shí)間的延長，不易流動水峰面積從1 d的2 864.92顯著降低至7 d的2 731.74(P<0.05)，但3種部位牛肉的A21差異不顯著(P>0.05)，這意味著不易流動水的含量隨成熟時(shí)間顯著下降(P<0.05)，3種部位之間的不易流動水含量無顯著差異(P>0.05)。自由水的峰面積A22在成熟過程中的變化與A21類似，隨成熟時(shí)間呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)。

2.2.2弛豫峰比例變化

弛豫峰面積百分比P2b、P21和P22反映了肉中結(jié)合水、不易流動水和自由水在總水分中所占的比例。由表3可知，背最長肌P2b在成熟1～3 d的變化不顯著(P>0.05)，但在5 d顯著降低至2.88%(P<0.05)，半膜肌P2b的變化較晚，在7 d時(shí)由3.04%顯著降低至2.44%(P<0.05)，腰大肌的變化趨勢與背最長肌和半膜肌均不同，于成熟3 d顯著降低至2.60%后，之后顯著升高至3.09%，在7 d又顯著降低至2.60%(P<0.05)，結(jié)合水比例的劇烈變化可能是不同部位牛肉自由水的損失速度不同所造成的。

表3 不同部位牛肉成熟過程中弛豫峰面積百分比P2變化

對于不易流動水峰面積百分比P21，3種部位牛肉的P21在成熟過程中變化趨勢相同，均隨成熟時(shí)間的進(jìn)行呈現(xiàn)顯著下降后上升的趨勢(P<0.05)，在成熟7 d，3種部位牛肉的P21均超過95%，顯著高于1 d(P<0.05)。且對比3種部位牛肉的P21發(fā)現(xiàn)，僅在成熟3 d腰大肌的P21顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)P21的差異不顯著(P>0.05)。P22變化的趨勢與P21不同，在成熟1 ～ 2 d時(shí)，背最長肌、半膜肌和腰大肌的P22分別顯著降低至1.89%、1.60%和1.66%(P<0.05)，在2 ～ 3 d又顯著升高(P<0.05)，且不同部位牛肉間的P22也有所差異。P22的變化表明在成熟期間自由水變化的復(fù)雜性，且不同部位牛肉間的自由水變化存在差異，但結(jié)合表2可以發(fā)現(xiàn)，A2b、A21和A22隨成熟時(shí)間的進(jìn)行而降低(P<0.05)，因此認(rèn)為在成熟期間3種部位牛肉的結(jié)合水、不易流動水和自由水均減少，結(jié)合水的變化表明部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性，與蛋白質(zhì)結(jié)合較弱的部分結(jié)合水流出肌細(xì)胞外[19-20]。3種水分比例的變化表明在成熟過程中，肉中水分的變化是動態(tài)的過程，且由于重力的作用，自由水逐漸流失。成熟2～5 d內(nèi)P22增加的原因可能是成熟過程中部分肌原纖維間的水分轉(zhuǎn)移至肌原纖維外的間隙，即不易流動水逐步向自由水轉(zhuǎn)化，較高的自由水比例造成成熟后期汁液損失增加[21]。

2.3 不同部位牛肉成熟過程中核磁成像變化

圖2表示成熟過程中3種部位牛肉氫質(zhì)子密度成像圖，顏色越深表示氫質(zhì)子密度越高，即自由水含水率高。顏色越淺表示肉中的氫質(zhì)子密度越低，自由水含水率越低[12,22]。隨著成熟時(shí)間延長，核磁成像圖像的顏色越來越淺，表明肉中的水分在損失。文獻(xiàn)[18]在測量時(shí)發(fā)現(xiàn)低保水性的樣品邊緣亮度增加，但在本研究中不同部位間核磁成像的變化結(jié)果之間的差異不大，且結(jié)合貯藏?fù)p失的結(jié)果分析，半膜肌的核磁成像邊緣與內(nèi)部區(qū)域相比未見明顯的亮度，可以得出3種部位冷卻牛肉的水分流失速率無明顯差異。此外，核磁圖像中出現(xiàn)亮色的條帶與成熟過程中的汁液流失通道的形成有關(guān)[23]。

分析部位之間保水性間的差異，除去肌肉類型的差異[7]和蛋白質(zhì)降解速率的差異[24-25]等因素，肉中的水分分布和轉(zhuǎn)化是影響保水性的又一大因素[23]。在整個成熟期間內(nèi)，僅在成熟3 d腰大肌的P21顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)P21的差異不顯著(P>0.05)。此外3種部位牛肉的總水分相對含量之間(A2total)無顯著性差異(P>0.05)，核磁成像的結(jié)果同樣支持該結(jié)論，顏色的變化并無明顯差異。因此分析認(rèn)為3種部位牛肉保水性存在差異的原因不是水分分布和含水率的差異性造成的。

2.4 不同部位牛肉成熟過程中肌細(xì)胞變化

圖3為背最長肌、半膜肌與腰大肌在成熟過程中的HE染色(蘇木精-伊紅染色法)圖像，從圖中可以看出在成熟前期肌細(xì)胞排列緊密且肌細(xì)胞維持良好的形態(tài)，腰大肌的細(xì)胞排列更緊密，背最長肌和半膜肌細(xì)胞間的空隙較大，隨著成熟的進(jìn)行，細(xì)胞不再維持良好的形態(tài)且發(fā)生破裂，致使細(xì)胞中的水分更易流失。文獻(xiàn)[26]認(rèn)為肌肉中的生理生化反應(yīng)會對肌肉的組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，并且會使隨后的蛋白質(zhì)變性呈現(xiàn)一定程度的差異，肌細(xì)胞的伸縮隨之受到影響，最終對牛肉的保水性產(chǎn)生影響。

2.4.1不同部位牛肉成熟過程中肌纖維直徑變化

由圖4(圖中a～d不同字母表示同一部位不同成熟時(shí)間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，x、y、z不同字母表示同一成熟時(shí)間不同部位差異達(dá)到顯著水平(P<0.05))可以看出，在成熟過程中3種部位牛肉的肌纖維直徑均呈現(xiàn)先顯著上升后下降的過程(P<0.05)，在成熟1～2 d牛肉的肌纖維直徑呈現(xiàn)顯著升高趨勢，2～7 d均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.05)。在整個成熟時(shí)間內(nèi)，腰大肌的肌纖維直徑均顯著低于背最長肌與半膜肌(P<0.05)，表明腰大肌的肌纖維直徑最低。成熟前5 d背最長肌的肌纖維直徑顯著高于半膜肌(P<0.05)，直到成熟7 d時(shí)，背最長肌與半膜肌的肌纖維直徑無顯著差異(P>0.05)。文獻(xiàn)[23]表明，肌肉縱向收縮的過程對肉中水分的流動性具有重要的影響，包括肌纖維、肌原纖維直徑的改變及肌節(jié)長度的改變，改變了弛豫水分的特征。結(jié)合圖3可以分析出，在成熟過程中，成熟前期(1～2 d)肌細(xì)胞發(fā)生膨脹，在成熟后期肌細(xì)胞皺縮并發(fā)生破裂，最終導(dǎo)致成熟7 d總水分損失的升高。

2.4.2不同部位牛肉成熟過程中肌節(jié)長度變化

表4為成熟過程中不同部位牛肉肌節(jié)長度的變化，部位、成熟時(shí)間及其交互作用對肌節(jié)長度影響顯著(P<0.01)。在成熟期間，對比不同部位牛肉的肌節(jié)長度來看，腰大肌的肌節(jié)長度顯著高于背最長肌和半膜肌，半膜肌的肌節(jié)長度最小(P<0.05)。對比不同部位牛肉的肌肉結(jié)構(gòu)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，腰大肌的肌纖維直徑均顯著低于背最長肌與半膜肌(P<0.05)，而腰大肌在整個成熟期間內(nèi)的肌節(jié)長度顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。由于肌節(jié)的單位體積是恒定的，在成熟過程中，3種部位之間隨著肌節(jié)的縮短造成肌原纖維直徑變大，肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維之間的空隙減??；同時(shí)伴隨肌纖維直徑的減小(圖4)，胞內(nèi)空間進(jìn)一步減小，造成肌原纖維間汁液流失，因而導(dǎo)致保水性降低[27]。由表4可知，在成熟后期，不同部位牛肉的肌節(jié)長度均呈現(xiàn)不同程度的增加，背最長肌和半膜肌在成熟7 d的肌節(jié)長度已經(jīng)超過成熟1 d，但腰大肌的肌節(jié)長度在成熟后期變化幅度不大。文獻(xiàn)[28]認(rèn)為肌節(jié)長度的變化影響肌球蛋白與肌動蛋白之間的儲水空間，通常認(rèn)為肌節(jié)長度越長，保水性越好，這與本研究結(jié)果一致。

表4 成熟過程中不同部位牛肉肌節(jié)長度

3 結(jié)束語

在成熟過程中，腰大肌的貯藏?fù)p失顯著低于背最長肌與半膜肌(P<0.05)，背最長肌和半膜肌的貯藏?fù)p失無顯著差異(P>0.05)。LF-NMR結(jié)果表明，3種部位牛肉水分變化和流失的速率一致，水分的變化速率并不是造成不同部位牛肉保水性存在差異的原因。不同部位牛肉的肌肉結(jié)構(gòu)存在差異，肌纖維直徑和肌節(jié)長度通過改變肌原纖維外部空間而影響保水性。本研究利用低場核磁共振技術(shù)、顯微成像技術(shù)對不同部位牛肉在成熟過程中的水分變化進(jìn)行探討，為研究肉品保水性和不同部位肉品質(zhì)差異提供理論依據(jù)。