曹鑫磊，姜浩,2，楊寶山，焦克芹，王惠*

(1.濟(jì)南大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022；2.山東省生態(tài)環(huán)境規(guī)劃研究院，山東 濟(jì)南 250101)

納米銀(AgNPs)作為使用廣泛的納米材料之一，因其優(yōu)良的抑菌性能而被廣泛應(yīng)用于紡織品、個(gè)人護(hù)理品、醫(yī)療器械、食品包裝材料等各類產(chǎn)品中[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球AgNPs用量占納米材料總用量的50%[3]，每年超過400 t的AgNPs被用于各種行業(yè)。AgNPs可通過多種途徑(污泥回田、噴灑殺蟲劑、污水灌溉等)進(jìn)入農(nóng)田土壤中，在歐美國(guó)家約有60%包含人工納米材料的污泥通過農(nóng)業(yè)施肥進(jìn)入農(nóng)田，長(zhǎng)期施用這些污泥必然導(dǎo)致農(nóng)田土壤中人工納米材料的積累[4]。而作為一種新型污染物，AgNPs在土壤中的積累可改變土壤的pH、有機(jī)碳含量及礦質(zhì)氮的含量[5]，并且釋放到環(huán)境中的AgNPs可通過微生物對(duì)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)循環(huán)過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[6]。AgNPs對(duì)微生物的抑制作用主要?dú)w因于其釋放的Ag+及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基所引發(fā)的蛋白失活、細(xì)胞膜破損、能量代謝受阻、DNA損傷等毒理效應(yīng)。但在實(shí)際環(huán)境暴露過程中，AgNPs易受到天然有機(jī)物質(zhì)、pH、溶解氧、陰/陽離子、光照等環(huán)境因素以及自身形貌、表面包埋劑等理化性質(zhì)的影響，導(dǎo)致其出現(xiàn)溶解、團(tuán)聚、沉淀等賦存狀態(tài)的改變，進(jìn)而影響其微生物毒性[7]。因此，AgNPs在土壤中的積累與遷移轉(zhuǎn)化及其對(duì)土壤微生物的毒性影響已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。

土壤呼吸作用和酶活性作為土壤毒理學(xué)研究的重要參考指標(biāo)，可以快速指示土壤系統(tǒng)中微生物活性和功能的變化趨勢(shì)。Shin等[8]發(fā)現(xiàn)，不同濃度的AgNPs處理土壤后，6種土壤酶(脫氫酶、FDA水解酶、脲酶、酸性磷酸酶、芳基硫酸酯酶和β-葡萄糖苷酶)活性均受到不同程度的抑制。Rahmatpour等[9]和王秋雙等[10]研究表明，中高濃度的AgNPs顯著抑制了土壤的呼吸作用。有關(guān)AgNPs對(duì)土壤微生物影響的研究指出，AgNPs可以顯著抑制土壤微生物的生長(zhǎng)，改變土壤細(xì)菌和真菌的群落組成，并降低土壤微生物的多樣性[10-14]。Grün等[15]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs對(duì)土壤中氨氧化菌和固氮菌會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)期抑制作用，進(jìn)而對(duì)土壤氮的循環(huán)過程造成不利影響。Samarajeewa等[12]和Sillen等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)AgNPs會(huì)造成微生物活性和多樣性下降，導(dǎo)致微生物對(duì)不同碳源的利用效率下降。而且AgNPs對(duì)土壤微生物的作用也受其濃度、粒徑大小以及土壤性質(zhì)的影響[16]。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中添加有機(jī)改良劑可使土壤中腐殖酸含量升高，導(dǎo)致AgNPs對(duì)土壤微生物生物量的抑制作用增強(qiáng)[17]。而秸稈還田作為一種常見的農(nóng)業(yè)土壤改良措施，能提高土壤肥力、增加土壤腐殖酸含量，使土壤性質(zhì)發(fā)生改變[18-19]?？紤]到AgNPs對(duì)土壤微生物的作用會(huì)隨著秸稈還田對(duì)土壤性質(zhì)的改變而發(fā)生變化，因此，探討其如何影響秸稈還田土壤中的土壤酶活性及微生物群落功能多樣性，對(duì)AgNPs的毒性管理具有重要意義。

基于此，本文采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究AgNPs對(duì)秸稈還田農(nóng)田土壤中碳循環(huán)相關(guān)生態(tài)過程及微生物群落功能多樣性的影響。通過測(cè)試土壤呼吸作用，觀察纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性及微生物群落功能多樣性的變化，為AgNPs毒性影響評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)踐參考，豐富AgNPs對(duì)土壤微生物影響的基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

AGS-WM1000 AgNPs溶液(上海滬正納米科技有限公司)，黃褐色液體，平均粒徑<15 nm，銀純度為99.99%，溶液pH (7.0 ± 0.5)。采集濟(jì)南地區(qū)小麥?zhǔn)崭詈蟮慕斩挘瑤Щ貙?shí)驗(yàn)室風(fēng)干，粉碎并過2 mm篩網(wǎng)。實(shí)驗(yàn)所使用的藥品純度均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

UV-5200紫外可見分光光度計(jì)(上海元析)；HBS-1096A Biolog Eco微孔板吸光值測(cè)定使用酶標(biāo)儀(南京德鐵)。

1.1.2 土壤采集

土壤樣品采集自山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)冬小麥-夏玉米輪作的農(nóng)田，取樣深度為0～20 cm。使用容重盒采集土壤計(jì)算含水率及田間最大持水量，土壤樣品采集完成后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，除去可見的植物根系、有機(jī)碎屑和石塊等雜質(zhì)，充分混勻后過2 mm篩網(wǎng)，取樣測(cè)定土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)，見表1。

表1 土壤理化性質(zhì)

1.2 樣品制備

過篩混勻后的土壤在(25±3) ℃，黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2周以穩(wěn)定微生物活性。2周后添加小麥秸稈和AgNPs。實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)置為空白對(duì)照組(無添加，CK)、土壤+小麥秸稈組(SW)、土壤+小麥秸稈+AgNPs組(AgSW)，供試土壤中小麥秸稈的添加量為5 g/kg[20]，AgNPs添加量為100 mg/kg[10,12,14]，調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的45%，每種實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3份。每份試樣中裝有相當(dāng)于1 kg干重的土壤。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 土壤呼吸作用測(cè)定

通過檢測(cè)土壤呼吸速率與CO2累積釋放量來檢測(cè)人工化學(xué)材料對(duì)土壤生物學(xué)活動(dòng)的影響，已被廣泛應(yīng)用于土壤污染的研究中[10]。

將3種處理的土壤(50 g干重)分裝于廣口瓶底部，保持土壤含水量為田間最大持水量的45%，放入裝有20 mL NaOH溶液(0.1 mol/L)的燒杯，旋緊瓶塞，用真空硅脂密封。廣口瓶置于(25±3)℃，黑暗條件的溫室中培養(yǎng)28 d，分別在第2、4、7、14、21、28 d取出NaOH溶液，用0.05 mol/L HCl進(jìn)行反滴定，計(jì)算CO2釋放量和釋放速率，每次取樣后重新補(bǔ)充NaOH溶液[21]。

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定

土壤微生物和土壤酶是影響土壤有機(jī)質(zhì)分解和腐殖質(zhì)形成的重要調(diào)節(jié)劑，土壤微生物為了滿足其生長(zhǎng)過程中對(duì)碳的需求，會(huì)分泌大量具有碳轉(zhuǎn)化功能的酶來分解秸稈中的碳水化合物[22]。酶活性的變化可用來表征微生物對(duì)AgNPs的響應(yīng)程度。

本文對(duì)土壤中的過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性進(jìn)行測(cè)定。土壤過氧化物酶能氧化土壤有機(jī)質(zhì)，其在土壤腐殖質(zhì)形成過程中具有重要作用[23]。多酚氧化酶能夠把土壤腐殖質(zhì)組分中芳香族化合物氧化成醌，醌與土壤中蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物等物質(zhì)反應(yīng)生成有機(jī)質(zhì)，完成土壤芳香族化合物循環(huán)，促進(jìn)土壤有機(jī)碳的累積及土壤腐殖化進(jìn)程[23]。纖維素酶分解纖維素形成纖維二糖，最后形成葡萄糖，是外源有機(jī)質(zhì)進(jìn)入土壤碳循環(huán)的重要過程[24]。

3種處理的土壤在(25±3) ℃，黑暗條件下培養(yǎng)28 d，并于實(shí)驗(yàn)的第1、7、28 d取樣測(cè)定土壤過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性。土壤多酚氧化酶和過氧化物酶活性采用鄰苯三酚比色法測(cè)定，其活性以2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的質(zhì)量表示。纖維素酶活性采用硝基水楊酸比色法測(cè)定，以72 h內(nèi)10 g土壤生成葡萄糖的質(zhì)量表示[24]。

1.3.3 微生物群落水平生理分析

微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)及能量流動(dòng)的主要參與者。因此，研究AgNPs對(duì)土壤微生物群落功能變化的影響，對(duì)于了解AgNPs對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的影響具有十分重要的意義。本研究采用微生物群落水平生理分析(microbial community level physiological profiling，CLPP)探究了AgNPs對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響。

使用Biolog Eco微孔板，每塊微孔板有96個(gè)孔，包含有3種處理的試樣，每種實(shí)驗(yàn)組有32孔(包括1個(gè)對(duì)照組孔和31個(gè)單一碳源孔)，除對(duì)照組孔僅有水與指示劑以外，其余31孔均裝有單一碳源和四唑氮藍(lán)染料。微生物利用單一碳源進(jìn)行代謝發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使四唑氮藍(lán)染料變成紫色，根據(jù)每孔顏色變化程度可檢測(cè)微生物的代謝能力。每個(gè)混合土樣稱取相當(dāng)于10 g烘干質(zhì)量的新鮮土，加入含90 mL 0.85% NaCl無菌溶液的三角瓶中，封口后在搖床上震蕩(200 r/min)30 min，按10倍稀釋法用0.85% NaCl無菌溶液將其稀釋至原來的1/1000，稀釋液經(jīng)離心去除土壤后，上清液用于接種。接種懸浮液于Biolog Eco微孔板中，每孔150 μL，置于25 ℃暗箱培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)240 h，期間每24 h用酶標(biāo)儀在590 nm處讀取吸光值。

土壤微生物群落Biolog Eco微孔板在培育過程中的整體變化過程使用平均孔顏色變化率(average well color development，AWCD)表示，其計(jì)算方法如式(1)[25-26]：

(1)

式中，I為平均孔顏色變化率；C為各反應(yīng)孔的吸光值，R為對(duì)照孔的吸光值。

采用Biolog Eco微孔板培養(yǎng)120 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù))H表征土壤微生物群落多樣性，其計(jì)算如式(2)[25-26]：

(2)

豐富度指被微生物群落利用的基質(zhì)的數(shù)量，若微孔的光密度值(O)大于0.25，則認(rèn)為是陽性值，并計(jì)入微生物群落的豐富度S(即此類光密度值大于0.25的微孔個(gè)數(shù)總和)計(jì)算如式(3)[25-26]:

S=Oi≥0.25。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNPs對(duì)土壤呼吸的影響

本實(shí)驗(yàn)利用土壤CO2釋放速率和總釋放量表征AgNPs對(duì)土壤微生物活性的影響，如圖1所示。結(jié)果表明AgNPs處理對(duì)土壤呼吸速率與CO2總釋放量產(chǎn)生抑制作用，表明100 mg/kg AgNPs可使土壤微生物活性降低。從第7 d開始，SW處理組的土壤呼吸速率均顯著高于CK處理組，這表明添加小麥秸稈增強(qiáng)了土壤的呼吸作用，第21 d兩者CO2釋放速率差值最大，SW組相比于CK組提升了9.9%。而與SW處理組相比，添加AgNPs顯著降低了土壤CO2釋放速率，這表明AgNPs抑制了土壤呼吸過程，且這種抑制作用在CO2總釋放量中體現(xiàn)更加明顯。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，AgSW處理組中CO2釋放總量相比于SW處理組降低了36.8%(圖1(b))。

圖1 AgNPs對(duì)秸稈還田土壤呼吸作用的影響Fig.1 Effect of AgNPs on respiration in wheat-straw-returned soil

Samarajeewa等[12]研究了AgNPs對(duì)沙壤土微生物呼吸作用的影響，發(fā)現(xiàn)AgNPs(> 49 mg/kg)抑制了土壤呼吸作用。Rahmatpour等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中AgNPs含量較高(> 20 mg/kg)時(shí)，土壤呼吸作用也被明顯抑制，且劑量越高抑制作用越大，這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。AgNPs對(duì)土壤呼吸的抑制作用可能歸因于AgNPs對(duì)微生物酶促過程、細(xì)胞功能和細(xì)胞核形成的負(fù)面影響[28-29]。土壤微生物可能表現(xiàn)出代謝功能障礙或者群落改變，導(dǎo)致微生物的繁殖降低、活性下降、呼吸作用減弱[30]。

2.2 AgNPs對(duì)土壤酶活性的影響

在添加小麥秸稈和AgNPs的條件下，土壤中過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性產(chǎn)生了不同的變化(圖2)。

注：a、b、c表示< 0.05水平的顯著性,字母不同表示顯著。圖2 AgNPs對(duì)秸稈還田土壤中過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性的影響Fig.2 Effect of AgNPs on peroxidase, polyphenol oxidase, and cellulase activities in wheat-straw-returned soil

SW處理中，由于添加了小麥秸稈，3種土壤酶活性均出現(xiàn)了不同程度的升高，其中纖維素酶活性受到的影響最大。相比于CK組，培養(yǎng)第7 d、第28 d，SW處理組的纖維素酶均顯著升高(圖2(c))。多酚氧化酶僅在第7 d受小麥秸稈影響活性顯著升高(圖2(b))，而在第1 d和28 d SW處理中，其活性雖有所升高但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。過氧化物酶在3個(gè)取樣點(diǎn)的SW處理組中升高程度均未達(dá)到顯著水平。

AgSW處理組3種碳轉(zhuǎn)化酶的活性均較低，其中過氧化物酶對(duì)AgNPs影響最為敏感。實(shí)驗(yàn)第1 d和第28 d，AgSW處理組的過氧化物酶活性相比SW組顯著降低了12.7%和25.1%(圖2(a))，這表明過氧化物酶對(duì)AgNPs較敏感，且AgNPs可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的氧化過程產(chǎn)生抑制，進(jìn)而可能對(duì)土壤腐殖質(zhì)形成過程產(chǎn)生負(fù)面影響。AgNPs對(duì)多酚氧化酶的影響出現(xiàn)在第7 d以后，酶活性相較于SW組，在第7 d和第28 d分別降低了8.0%和27.1%(圖2(b))。過氧化物酶和多酚氧化酶活性變化表明，AgNPs可抑制土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和腐殖質(zhì)的形成。纖維素酶活性受AgNPs的影響最小，在3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)相較于SW組，活性分別降低了5.6%、14.3%和13.7%(圖2(c))。而纖維素酶活性的結(jié)果也表明AgNPs對(duì)纖維素分解過程產(chǎn)生了抑制。

Shin等[8]發(fā)現(xiàn)，在短期AgNPs暴露實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的AgNPs處理土壤后，參與土壤碳循環(huán)的β-葡萄糖苷酶活性受到抑制。彭程等[31]研究結(jié)果也表明，AgNPs抑制了β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶兩種參與碳循環(huán)酶的活性。本研究中對(duì)3種酶的研究結(jié)果同樣表明AgNPs抑制了土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和腐殖質(zhì)形成以及纖維素的分解過程，對(duì)土壤碳循環(huán)產(chǎn)生了抑制作用。有關(guān)納米金屬顆粒對(duì)分子生物學(xué)影響的研究表明，AgNPs對(duì)土壤酶產(chǎn)生抑制作用的原因可能是AgNPs通過滅活蛋白質(zhì)或阻斷酶上的結(jié)合位點(diǎn)來抑制酶活性，也可能是由于其粒徑小，易進(jìn)入微生物內(nèi)部產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致微生物死亡從而抑制酶的產(chǎn)生和釋放，進(jìn)而對(duì)土壤中某些酶的活性產(chǎn)生影響[32]。

2.3 AgNPs對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響

平均孔顏色變化率(AWCD)的測(cè)試結(jié)果表明(圖3)，暴露于AgNPs的樣品總是比CK組和SW組值更低。培養(yǎng)240 h后，與CK相比，SW處理組的AWCD增加了13.6%，AgSW處理組相比SW組則減少了73.8%。

圖3 3種不同處理土壤微生物群落AWCD隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes in average well color development (AWCD) of the soil microbial community under three different treatments over time

從AWCD隨時(shí)間變化趨勢(shì)上可以發(fā)現(xiàn)，AgSW處理的AWCD值增長(zhǎng)具有明顯的滯后性。而AWCD能夠表征微生物群落對(duì)不同碳源的利用能力，其值增長(zhǎng)緩慢表明AgNPs導(dǎo)致土壤微生物群落功能多樣性發(fā)生了改變。這與Sillen等[12]的研究結(jié)果相同，其研究利用CLPP技術(shù)分析添加AgNPs后土壤中根際和非根際微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)含有AgNPs的樣品相較于對(duì)照組，AWCD升高緩慢，并且培養(yǎng)結(jié)束時(shí)AWCD值顯著低于對(duì)照組，表明AgNPs使土壤中根際和非根際微生物功能多樣性(碳源利用方式)發(fā)生了變化，導(dǎo)致土壤微生物群落功能多樣性和微生物的活性降低，這也解釋了本研究AWCD的變化結(jié)果。

由表2可知，AgSW處理組與SW處理組相比，微生物香農(nóng)指數(shù)和群落豐富度顯著降低。雖然添加小麥秸稈使AWCD、香農(nóng)指數(shù)和群落豐富度出現(xiàn)升高，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平(表2)。

表2 不同處理土壤微生物群落多樣性指數(shù)

總體而言，CLPP的結(jié)果表明AgNPs使微生物多樣性與群落豐富度下降，土壤微生物群落功能多樣性顯著降低。該結(jié)果與Samarajeewa等[12]的研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)AgNPs在49～1815 mg/kg的濃度范圍內(nèi)對(duì)微生物生長(zhǎng)、活性和多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響。產(chǎn)生負(fù)面影響的原因可能與AgNPs引起的活性氧(ROS)氧化應(yīng)激有關(guān)[33]，且AgNPs還可以通過與生物大分子反應(yīng)或釋放Ag+等有毒成分來產(chǎn)生抑制作用。一般認(rèn)為，AgNPs可通過直接接觸、誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和釋放毒性離子等方式，造成膜損傷、DNA損傷和細(xì)胞信號(hào)受阻，進(jìn)而影響微生物活性，對(duì)微生物群落功能多樣性產(chǎn)生影響[34]。

2.4 AgNPs對(duì)所測(cè)土壤指標(biāo)影響的冗余分析

為了更加直觀地表達(dá)AgNPs對(duì)土壤呼吸作用、酶活性以及微生物的影響，采用Canoco 5.0對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行了冗余分析(redundancy analysis，RDA)，結(jié)果如圖4所示。RDA分析顯示第一和第二坐標(biāo)軸累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到96.37%，且AgNPs與所測(cè)試的土壤指標(biāo)均呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。受AgNPs負(fù)面影響最小的是土壤纖維素酶活性，而土壤呼吸速率、香農(nóng)指數(shù)以及群落豐富度與AgNPs的負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)。土壤呼吸速率、土壤酶活性均與微生物多樣性和群落豐富存在正相關(guān)關(guān)系。

圖4 AgNPs與測(cè)試指標(biāo)間的冗余分析Fig.4 Comparative redundancy analysis of AgNPs and test indicators

3 結(jié)論

由于AgNPs在環(huán)境中排放持續(xù)增加，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響必然是一個(gè)長(zhǎng)期且復(fù)雜的過程。本研究初步闡釋了100 mg/kg AgNPs短期內(nèi)對(duì)秸稈還田土壤呼吸速率、土壤酶活性及微生物群落功能多樣性的影響。

(1)在短期培養(yǎng)中AgNPs抑制秸稈還田土壤的呼吸作用，具體表現(xiàn)為土壤CO2釋放速率降低以及累積CO2釋放量減少(36.8%)。

(2)AgNPs污染土壤后，3種碳循環(huán)相關(guān)土壤酶活性出現(xiàn)了不同程度的降低，其中過氧化物酶活性受AgNPs影響最大，多酚氧化酶次之，而纖維素酶活性受影響最小。

(3)CLPP分析的結(jié)果顯示，AgSW處理組AWCD值、香農(nóng)指數(shù)及微生物群落豐富度顯著降低。AgNPs減少了土壤中微生物多樣性和群落豐富度，降低了微生物群落功能多樣性。

雖然CLPP技術(shù)可以準(zhǔn)確、可靠地反映和比較微生物群落對(duì)AgNPs的響應(yīng)，可用于研究不同環(huán)境條件下微生物群落功能的變化，但不能全面評(píng)價(jià)土壤微生物在不同分類單元上的差異，之后需要通過更加全面的土壤微生物分析技術(shù)，例如高通量測(cè)序和土壤官能團(tuán)分析技術(shù)進(jìn)行更深入、更有針對(duì)性的研究。