“溫升三陰，肅金秘陽法”抗肝癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

邱祥玉，謝星星，宋 娜，虎雅敏，關(guān)東龍，吳施國

(云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

“溫升三陰，肅金秘陽法”是建立在云南吳氏扶陽學(xué)術(shù)基礎(chǔ)上形成的一種治療原則和方法?！皽厣幏ā庇糜谥委煛瓣査リ幨?，三陰臟寒”所致的三陰不升，人體氣機圓運動失常[1]。所謂“三陰”是指少陰腎、太陰脾和厥陰肝。三陰陽氣的升發(fā)是整個人體氣機圓運動的運行不息的關(guān)鍵，即名為“溫升三陰法”。在人體氣機圓運動中，有升才有降，有左升也需有右降，左升者，溫升三陰，右降者，肅降三陽也。肝木、脾土，升于左，則胃土、肺金、膽火需降于右，升降循環(huán)，周流不息，是以整個氣機的圓運動得以正常地運轉(zhuǎn)。吳榮祖教授在此理論原則之下：予以吳萸四逆湯“溫升三陰”，同時予以杏仁肅降肺金，厚樸肅降胃土，烏梅斂降膽火，三者共取“肅金”右降之意。同時吳榮祖教授認(rèn)為腎水寒則龍浮，相火不能潛藏其位，而浮越于上，故在溫升三陰的基礎(chǔ)上，需引火歸元?！包S柏、砂仁、甘草”三味藥為封髓丹，予之以取“秘陽”之意。少陰陽衰，火不暖土，脾失健運，水濕不化，取苓桂術(shù)甘湯，燥土濕以助陽左升。

原發(fā)性肝癌（又稱肝細(xì)胞癌）是臨床中最常見且惡性程度較高的腫瘤之一，2020年我國肝癌發(fā)病人數(shù)達41萬，死亡人數(shù)39萬，死亡率高達95%，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康，手術(shù)、介入、放化療雖然有一定效果，但作用有限[2-3]。吳榮祖教授在臨床上運用“溫升三陰，肅金秘陽法”治療內(nèi)、外、婦、兒等疑難雜癥，取效頗佳。在治療肝癌上亦有較好的臨床療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)平臺，分析藥物、疾病、靶點相互作用的機制，與中醫(yī)藥多靶點、多成分特點相一致，有利于中藥及中藥復(fù)方活性成分研究及機制探索[4-5]。本文基于“溫升三陰，肅金秘陽法”的立法理論，取吳萸四逆湯溫升三陰，苓桂術(shù)甘湯溫陽健脾，杏仁、厚樸、烏梅肅降肺胃、膽火以“肅金”，封髓丹“秘陽”。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究在此大法下4個不同治法、方藥治療肝癌的藥效活性成分及可能的分子機制，為豐富此理論及后續(xù)實驗研究提供一定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 活性成分的篩選 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺 （TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]查詢溫升三陰法對應(yīng)中藥（吳茱萸、附子、干姜、甘草），溫陽化飲法對應(yīng)中藥（茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草），肅金法對應(yīng)中藥（杏仁、厚樸、烏梅），秘陽法對應(yīng)中藥（黃柏、砂仁、甘草）的化學(xué)成分，并進一步收集各味中藥中口服生物利用度（OB≥30%）和藥物相似性（DL≥0.18）的活性成分，以納入后續(xù)研究。

1.2 活性成分靶點預(yù)測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢上述代表藥物活性成分對應(yīng)的靶點信息，以（Homo Sapiens）為檢索條件在蛋白數(shù)據(jù)庫（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）[7]進行檢索，并將獲得的各個靶蛋白對應(yīng)的靶基因名換成對應(yīng)的基因Symbol。

1.3 肝癌疾病靶點預(yù)測 以英文“hepatocellular carcinoma”為 關(guān) 鍵 詞 分 別 在 GeneCards（http：//www.genecards/）[8]，OMIM（http：//omim.org/）[9]疾 病 數(shù)據(jù) 庫檢索肝癌靶點基因。

1.4 潛在作用靶點預(yù)測 運用R語言對藥物成分的預(yù)測靶點和疾病靶點進行映射取交集，獲得“溫升三陰，肅金秘陽”法治療肝癌的潛在作用靶點。

1.5 構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 運用Cytoscape3.7.2軟件對獲取的中藥有效成分靶點構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cyto Hubba插件進一步分析該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分。根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列15位的關(guān)鍵靶蛋白。

1.6 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點分析將1.4所得交集基因?qū)нMSTRING（https：//string-db.org/）[10]數(shù)據(jù)分析平臺進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。選擇“Multiple proteins”作為分析模式，“Homo sapiens”用于生物種類限制，同時選擇置信度為≥0.90進一步篩選并隱藏孤立蛋白后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用R語言 4.0 軟件（https：//www.r-project.org/）對該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點蛋白進行分析。

1.7 將4個治法下的藥物活性成分靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 用Cyto Hubba插件分析每個治法網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列前4的關(guān)鍵活性成分。

1.8 GO富集分析與KEGG富集分析 為了進一步分析“溫升三陰，肅金秘陽法”作用肝癌的可能機制，利用 DAVID 數(shù)據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）對210個潛在靶點進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，分別研究“溫升三陰，肅金秘陽法”的主要生物功能與主要信號通路，并運用Graphpad Prism8.0.1.244x64軟件對GO富集中的BP（生物進程）和KEGG富集排名靠前的通路條目繪制成柱狀圖。

1.9 核心活性成分與核心靶點分子對接 通過PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點蛋白PDB ID并保存為pdb格式。在TCMSP數(shù)據(jù)庫查找關(guān)鍵的有效成分信息，下載并保存為mol2格式。利用AutoDock Tools軟件將關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點完成分子對接，再通過pymol軟件對所得結(jié)果進行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 TCMSP數(shù)據(jù)庫有效成分檢索結(jié)果 根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索并篩選得到253個有效成分（已刪除重復(fù)值）。其中溫升三陰法中148個有效成分，溫陽健脾法中121個有效成分，肅降肺胃中29個有效成分，秘陽法中139個有效成分。

2.2 肝癌潛在作用靶點 將藥物活性成分靶點基因229個，與疾病所得的相關(guān)靶點取交集，獲得210個交集基因為“溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌的潛在作用靶點（見圖1）。

圖1 “溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌的靶點篩選圖

2.3 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析

2.3.1 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將所得210個交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。去除游離節(jié)點后，網(wǎng)絡(luò)中包含210個靶點，818條相互作用連線。

2.3.2 關(guān)鍵基因分析 為進一步分析網(wǎng)絡(luò)中重要的核心靶點，利用R語言進行篩選并根據(jù)度值將PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點繪制條形圖（見圖2）。在該PPI網(wǎng)絡(luò)中其中度值較大的有STAT3（度值=31）、JUN（度值=29）、HSP90AA1（度值=25）、AKT1（度值=24）、MAKP1（度值=23）、MAKP3（度值=22），IL6（度值=18）等，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其中STAT3是度值最高的。

圖2 “溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶蛋白

2.4 “中藥-化合物-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到253個有效成分及2.2中獲得的交集基因上傳至Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。

圖3 “溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌的“中藥-化合物-治療靶點”圖

在中藥-化合物-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖上采用Cyto Hubba插件進行分析，根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列前15位的關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵活性成分（見表1）。

表1 “溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌中根據(jù)degree值排列的前15個化合物及靶點信息

2.5 “溫升三陰，肅金秘陽法”下4個不同治法的關(guān)鍵活性成分及核心作用靶點

2.5.1 4個不同治法的關(guān)鍵活性成分 將“溫升三陰，肅金秘陽法”4個不同治法下的藥物活性成分及靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，用Cyto Hubba插件分析每個治法網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，根據(jù)degree值分別選取各個網(wǎng)絡(luò)中排名前4位的關(guān)鍵活性成分（見表2-表5）。

表2 “溫升三陰”網(wǎng)絡(luò)中排名前4活性成分

表3 “溫陽健脾”網(wǎng)絡(luò)中排名前4活性成分

表4 “肅金”網(wǎng)絡(luò)中排名前4的活性成分

表5 “秘陽法”網(wǎng)絡(luò)中排名前4的活性成分

2.5.2 4個不同治法網(wǎng)絡(luò)下關(guān)鍵活性成分與靶點的關(guān)系 為了進一步分析不同網(wǎng)絡(luò)中活性成分與靶點的關(guān)系，據(jù)Cyto Hubba插件中的degree值，取網(wǎng)絡(luò)中排名前12的核心信息。見圖4-圖7。

圖4 “溫升三陰法”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖5 “溫陽健脾”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖6 “肅金”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖7 “秘陽法”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

2.6 GO富集分析結(jié)果 將210個關(guān)鍵靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，其中RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原過程、藥物反應(yīng)、凋亡過程、炎癥反應(yīng)等是BP（生物進程）分析中靠前的條目（見圖8）。提示“溫升三陰，肅金秘陽法”在治療肝癌過程中通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮作用。

圖8 生物進程（BP）富集分析圖

2.7 KEGG富集分析結(jié)果 通過KEGG通路富集分析，取“溫升三陰，肅金秘陽法”顯著發(fā)揮影響的30條通路（見圖9）。結(jié)果顯示，其治療肝癌的機制主要涉及癌癥信號通路，PI3K/Akt信號通路、Hepatitis B信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路（見圖10）等。

圖9 KEGG信號通路富集圖

圖10 “溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌的PI3K/Akt信號通路圖

2.8 分子對接 在“溫升三陰，肅金秘法”的每個治法網(wǎng)絡(luò)中，MOL000098槲皮素（quercetin）為4個治法共同的活性成分也是預(yù)測靶點最多的。PTGS2為中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的靶點，同時也是四個治法網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的核心靶點之一。因此，將二者選為分子對接的配體和受體。在PDB上檢索到PTGS2蛋白ID為5f19并下載其3D結(jié)構(gòu)。分子對接結(jié)果顯示槲皮素（quercetin）能穩(wěn)定地對接到PTGS2蛋白結(jié)構(gòu)5f19中，二者通過氨基酸殘基ARG-376，ASN-375相互發(fā)生作用。

圖11 核心靶點的分子對接

3 討論

“溫升三陰，肅金秘陽法”旨在恢復(fù)三陰臟寒所致的氣機圓運失常。在此法中，運轉(zhuǎn)的圓運動由“中土為軸，金木水火四象為輪”共同構(gòu)成。少陰腎為命門之火，其溫煦及氣化的作用是圓運動的動力，脾居中央是氣機升降之樞紐，脾陽旺盛帶動圓運動中軸的運行，肝木升發(fā)標(biāo)著圓運動正常啟功、運行[1]。四逆湯為補火助陽，回陽救逆之要方。吳榮祖教授認(rèn)為四逆湯中之附子主要用于升舉足少陰腎的陽氣，作用十分重要；干姜用以溫中散寒，炙甘草用以補土以伏火，二藥共用，共同升舉足太陰陽氣；吳茱萸，性溫，入肝經(jīng)，可通過溫散厥陰之寒達到升足厥陰肝陽氣的作用。故“溫升三陰法”在治療上即體現(xiàn)在吳萸四逆湯上。彭子益所著的《圓運動之古中醫(yī)學(xué)》中云：“杏仁降肺金，開斂結(jié)以降肺火，肺金降則相火便降”；“厚樸降膽理胃[11]”，說明了杏仁、厚樸降肺金、胃土、膽火之用，在此取之以“肅金”之意?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩疲骸胺碴庩栔?，陽密乃固”，只有腎中之水將命門之火潛藏其中才是實質(zhì)意義上的溫陽[12]。故而吳榮祖教授認(rèn)為“溫陽”需與“秘陽”共舉，創(chuàng)“秘陽法”?！懊仃柗ā笔轻槍Α澳I陽虛衰，相火不密”而創(chuàng)以“溫水潛陽，引火歸元”的一種治療方法[13]。此處取“黃柏、砂仁、甘草”三味藥。苓桂術(shù)甘湯可溫健中軸脾陽以化飲，消散三陰臟寒停滯之寒飲[1]。故，藥物吳茱萸、附子、干姜、甘草、茯苓、白術(shù)、桂枝、杏仁、厚樸、烏梅、黃柏、砂仁共同構(gòu)建了“溫升三陰、肅金秘陽”的大法。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對“溫升三陰，肅金秘陽法”下各個不同治法抗肝癌作用進行研究。全網(wǎng)絡(luò)共篩選出210個潛在治療靶點，利用STRING數(shù)據(jù)分析平臺得出 PPI靶點互作網(wǎng)絡(luò)中 STAT3、JUN、HSP90AA1、AKT1是治療的核心靶點。STAT3作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，在肝癌的炎癥微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。STAT3不僅參與肝癌的“炎癌轉(zhuǎn)化”，還可直接調(diào)控肝癌細(xì)胞內(nèi)與增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達，甚至與肝癌血管生成和免疫抑制有關(guān)[14-15]。STAT3被磷酸化后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過對 Mcl-1、Bcl-xl、c-myc和 Survivin基因表達的調(diào)控，促進細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡[16]。c-Jun是細(xì)胞增殖過程中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過拮抗抑癌基因p53的活性，抑制肝癌細(xì)胞凋亡[17]。c-Jun在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，有研究表明被敲除c-Jun的HBV小鼠，其腫瘤生長受到了抑制[18]。熱休克蛋白90a（HSP90AA1）與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成有密切關(guān)系[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20]HSP90AA1的mRNA隨著肝癌TNM分期升高，其表達量隨之升高。AKT是本文PPI網(wǎng)絡(luò)中核心治療靶點之一，是PI3K/Akt信號通路中重要的下游靶標(biāo)，被磷酸化激活后的AKT是原發(fā)性肝癌預(yù)后不良的危險因素[21]。異常激活的AKT可存在于多種癌癥中，參與癌細(xì)胞的代謝，抑制癌細(xì)胞凋亡，促進癌細(xì)胞增殖以及血管生成[22]。抑制AKT以及磷酸化AKT的表達水平有助于阻滯細(xì)胞周期，促進肝癌細(xì)胞的凋亡[23]。

通過網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅是“溫升三陰，肅金秘陽法”治療肝癌網(wǎng)絡(luò)中度值最高的也是4個治法下度值最高的活性成分。山柰酚是“溫升三陰”、“溫陽健脾”以及“肅金”3個治法的共有關(guān)鍵成分。β-谷甾醇是“溫陽健脾”、“肅金”以及“秘陽”法的共有關(guān)鍵成分?，F(xiàn)代研究證明槲皮素是黃酮類化合物的主要成分，對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤均有抑制作用。將槲皮素作用于人肝癌細(xì)胞株Hep3、Huh7、HepG2，其結(jié)果顯示槲皮素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[24-25]。也可以降低自由基等損傷產(chǎn)物水平以發(fā)揮保肝作用[26]。有研究采用人肝癌LM3模型和裸鼠肝癌模型來觀察槲皮素對肝癌的作用，其結(jié)果表明槲皮素可抑制肝癌的發(fā)展，機制可能是通過作用于JAK2/STAT3信號通路以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移和自噬[27]。也有研究表明槲皮素可以抑制被生長因子磷酸化的AKT，從而抑制AKT信號通路誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞遷移[28]?！白允杉?xì)胞死亡”被認(rèn)為是持續(xù)的自噬激活而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。山柰酚可誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞非凋亡性死亡，其原因可能是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬激活[29]。有實驗證明，β－谷甾醇可以上調(diào)Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達來促進肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[30]。此外，李慶勇[31]等人發(fā)現(xiàn)β－谷甾醇和豆甾醇具有抑制肝癌細(xì)胞SMMC－7721的增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用。

PTGS2是本文中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的靶標(biāo)，在分子對接中亦與槲皮素穩(wěn)定結(jié)合。PTGS2是PTGS誘導(dǎo)型基因中的一種，PTGS2也稱環(huán)氧合酶2（COX-2）。有研究報道PTGS2在肝癌中高表達[32]，此外謝詠梅[33]等人，用western blot檢測肝炎、肝硬化、癌前病變及肝癌手術(shù)標(biāo)本的COX-2蛋白表達含量，其結(jié)果表明在肝硬化組織中COX-2呈現(xiàn)峰值，表明COX-2可能誘導(dǎo)肝硬化發(fā)生癌變。相關(guān)研究證明[34]美洛昔康作為一種選擇性環(huán)氧合酶2抑制劑，在體外和體內(nèi)均具有抗肝癌細(xì)胞增殖和抗血管生成的作用，其機制可能是通過降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活和表達從而抑制肝癌細(xì)胞血管生成，促進細(xì)胞凋亡。

綜上所述，“溫升三陰，肅金秘陽法”具有多成分、多靶點、多通路治療肝癌的作用模式，其作用的機制可能是通過槲皮素等多種有效成分作用于PTGS2、STAT3、AKT等蛋白調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及調(diào)控多種生物學(xué)功能和PI3K/Akt、TNF等信號通路發(fā)揮抗肝癌作用。從分子水平揭示該治療大法治療肝癌的潛在化學(xué)成分及潛在作用機制，為下一步深入實驗驗證提供一定的理論依據(jù)。