CIP2A在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用

丁亞云，祁 昌

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種病因未知的慢性自身免疫性炎癥性疾病，主要累及手部與足部的小關(guān)節(jié)，大關(guān)節(jié)也常受累及。目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已經(jīng)成為造成人類喪失勞動(dòng)力的主要疾病之一。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子的刺激下，免疫系統(tǒng)被激活，滑膜組織中各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織被刺激后明顯增生，造成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期病變形成。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要的治療途徑為藥物治療，如抗炎藥物、激素、免疫抑制劑、生物制劑等治療[1-3]，盡管國(guó)內(nèi)外關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究越來(lái)越深入，其致病機(jī)理至今未明。這就要求人們進(jìn)一步深入研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病機(jī)理，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供更加有效的治療靶點(diǎn)。

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A, CIP2A）是2000年科學(xué)家克隆出來(lái)的基因片段，編碼的靶蛋白主要定位在人類腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[4]。目前為止，已在人類許多惡性腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)CIP2A蛋白的過(guò)表達(dá)[5-7]，研究發(fā)現(xiàn)CIP2A與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理改變主要發(fā)生在滑膜襯里層，而構(gòu)成襯里層主要的成纖維樣滑膜細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，活化的成纖維樣滑膜細(xì)胞可以產(chǎn)生新的生物學(xué)特性，如過(guò)度增殖、細(xì)胞侵襲及凋亡耐受等[8-10]，有趣的是CIP2A對(duì)多數(shù)增殖的細(xì)胞中起重要作用[11-15]，本研究目的就是探討CIP2A在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 小鼠CIA模型的制備 無(wú)菌條件下通過(guò)3 mL冰乙酸中溶解12 mg牛Ⅱ型膠原（CⅡ），CⅡ濃度為4 mg/mL溶液。將3 mL福氏完全佐劑與3 mL上述配置溶液同比例混合，再取所得混合液100 μL經(jīng)小鼠皮內(nèi)注射，且在21 d后再次免疫。足趾厚度通過(guò)游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量。每?jī)商鞙y(cè)1 次關(guān)節(jié)炎評(píng)分與足趾厚度，通過(guò)兩名實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立完成操作。

1.2 H&E染色判斷炎癥浸潤(rùn)程度 將模型鼠及正常鼠的關(guān)節(jié)取出固定在多聚甲醛中24 h，24 h后將各組的小鼠標(biāo)本放在EDTA脫鈣液中進(jìn)行脫鈣1 個(gè)月時(shí)間，待小鼠的關(guān)節(jié)組織右手彎曲后可以達(dá)到120°時(shí)，將關(guān)節(jié)進(jìn)行梯度脫水及浸蠟，將脫好水的標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，放置冷卻臺(tái)上進(jìn)行冷卻，在蠟塊達(dá)到一定的硬度后，將其切成4 μm的片子，如果脫鈣未完全可以再次重復(fù)脫鈣，直至完全脫鈣，然后將切好的片子進(jìn)行烘片，烘片15 min后將片子進(jìn)行HE染色，最后在顯微鏡下進(jìn)行炎癥嚴(yán)重程度評(píng)估。

1.3 PCR 將正常小鼠及模型的滑膜組織從膝關(guān)節(jié)中取出，用Trizol裂解法將RNA提取出來(lái)，檢測(cè)RNA的濃度，將RNA定量至1 μg的體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR實(shí)驗(yàn)所用的引物由primer bank查找，在NCBI的網(wǎng)頁(yè)中進(jìn)行比對(duì)，亦可以用Primer 3軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，最后由上海生工公司進(jìn)行合成，具體序列為：CIP2A-F ctg tcg ggg tac tcc ctt gta，CIP2A-R tct act tgc cga gca agg ct，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得最佳的PCR體系，最后將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CIP2A是重要的原癌基因，在乳腺癌、腸癌及膀胱癌等多種腫瘤中高表達(dá)，研究表明CIP2A的表達(dá)增高與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖密切相關(guān)?；ぴ錾穷愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最主要的病理特征之一，骨關(guān)節(jié)在長(zhǎng)期炎癥的刺激下，關(guān)節(jié)間質(zhì)組織會(huì)代償增生修復(fù)，但是滑膜過(guò)度增生又會(huì)加重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞，滑膜細(xì)胞在炎癥因子的刺激下，細(xì)胞的生物性狀改變明顯，滑膜細(xì)胞出現(xiàn)腫瘤樣生長(zhǎng)，增生侵襲周圍骨質(zhì)。本課題首先利用CⅡ人皮下注射DBA小鼠誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，我們成功構(gòu)建了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型（圖1A），為進(jìn)一步明確類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型鼠的病理特征改變，我們對(duì)小鼠的關(guān)節(jié)組織進(jìn)行了HE染色（圖1B），其結(jié)果顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型組的小鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)了明顯破壞，關(guān)節(jié)面毛糙，骨質(zhì)破壞明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜增生，反映了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的典型病理表現(xiàn)，另外我們應(yīng)用熒光定量方法檢測(cè)了CIP2A分子表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIP2A分子在滑膜中表達(dá)增高（圖1C），根據(jù)以上結(jié)果我們推測(cè)CIP2A的高表達(dá)可能與滑膜增生有關(guān)，其可能參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

圖1 CIP2A在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)增高。A：CⅡ皮下注射給DBA小鼠誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠；B：取DBA類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型鼠的關(guān)節(jié)部位，進(jìn)行固定脫水包埋等，并將蠟塊進(jìn)行HE組織染色，相比較正常的DBA小鼠，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型鼠的HE染色顯示骨組織破壞明顯，關(guān)節(jié)面粗糙，軟骨破壞嚴(yán)重；C：熒光定量PCR檢測(cè)CIP2A在滑膜中的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠均為5 只，P＝0.0028。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種病因未知的慢性自身免疫性炎癥性疾病，主要累及手足部的關(guān)節(jié)，大關(guān)節(jié)也常受累及。其主要的發(fā)病機(jī)理為免疫系統(tǒng)被激活后免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)、滑膜組織的異常增生侵襲及骨質(zhì)的破壞。美國(guó)疾控中心曾統(tǒng)計(jì)過(guò)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在全球的發(fā)病率0.5%～1%，而我國(guó)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率0.32%～0.36%。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎除了致殘和降低生活質(zhì)量，還可能加速動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程，大大縮短患病人群的預(yù)期壽命[16]。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，該病具有遺傳易感性，一些基因如HLA-DRB1及其同位基因是該疾病最重要的相關(guān)基因[17]，在固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答被激活后，在各種炎癥因子的長(zhǎng)期慢性刺激下，滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織增生，造成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期病變形成。盡管國(guó)內(nèi)外關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究越來(lái)越深入，其致病機(jī)理至今未明。雖然類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的預(yù)后在現(xiàn)代化的治療途徑下已經(jīng)有了很大的改善，但致殘率仍然非常高。這就要求人們進(jìn)一步深入研究其致病機(jī)理，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供更加有效的治療靶點(diǎn)。

既往很多文獻(xiàn)顯示CIP2A在多種腫瘤中表達(dá)明顯增高[18-20]，且與腫瘤的進(jìn)行性進(jìn)展明顯相關(guān)，在體驗(yàn)研究中我們將CIP2A分子敲降后，很多細(xì)胞株的增殖水平顯著下降，這些結(jié)果均提示我們CIP2A分子與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，而在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中成纖維樣滑膜細(xì)胞在炎癥因子刺激下，處于活化狀態(tài)，增殖能力顯著增強(qiáng)，于是我們構(gòu)建了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型，并對(duì)造模后的小鼠模型進(jìn)行HE染色、病理鑒定，我們通過(guò)提取模型組與正常組小鼠中的滑膜組織，將其裂解，熒光定量檢測(cè)滑膜中CIP2A分子的含量，結(jié)果顯示CIP2A分子在模型組的滑膜組織中顯著增高，有效提示CIP2A分子很可能參與到成纖維樣滑膜組織的增殖及活化中，我們推測(cè)CIP2A分子可能參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。